32102 Sp-dCas9 Nuclease
产品概述
■ 产品描述
SpCas9来源于S. pyogenes菌株，是依赖于crRNA和tracrRNA(或连接后形成的sgRNA)引导的DNA内切核酸酶，在靶标双链DNA存在PAM (NGG) 的情况下，特异地切割靶标双链 DNA，使DNA双链断裂并生成平末端。PAM对于SpCas9的识别和切割都是必需的，其切割位点位于目标序列(target sequence)内，离PAM区3个碱基。SpCas9酶的HNH和RuvC结构域分别负责切割靶标双链DNA中与sgRNA配对和非配对的链。本产品中，SpCas9的H840和D10都被突变为A，从而使其HNH和RuvC功能域失活，获得了Sp-dCas9酶。因此，Sp-dCas9 只有结合靶标DNA的活性，而没有切割靶标DNA的活性。
■ 产品组分
| 组分 | 32102-01 (100 pmol) | 32102-03 (1,000 pmol) |
 Sp-dCas9 Nuclease (10 μM) a |
100 pmol | 1,000 pmol |
 10 × HOLMES Buffer for Cas9 |
1 mL | 1 mL |
a. Sp-dCas9 Nuclease浓度为10 μM，即10 pmol/μL，100 pmol规格的总体积为10 μL，1,000 pmol规格的总体积为100 μL；
■ 保存条件
-20℃储存。
■ 产品优势
● 高纯度 ● 高灵敏度 ● 高特异性
■ 实验流程
1.顺式剪切实验
| 组分 | 体积 | 终浓度 |
| 10 × HOLMES Buffer for Cas9 | 2 μL | 1 × |
| 10 μM Sp-dCas9 Nuclease | 1 μL | 500 nM |
| 10 μM sgRNA | 1.5 μL | 750 nM |
| 1 μM Substrate dsDNA | 3 μL | 150 nM |
| Nuclease-free water | Up to 20 μL |
37℃反应30 min，可通过非变性核酸电泳对实验结果进行分析。
■ 实验结果
为了验证Sp-dCas9与target DNA的结合，我们通过5′端带FAM基团的引物在全长59 bp的target dsDNA末端加上FAM标记。在20 μL反应体系中加入2 μL的10 ×HOLMES Buffer for Cas9, 1 μL的10 μM Sp-dCas9 Nuclease, 1.5 μL的10 μM sgRNA, 和3 μL的1 μM target dsDNA-FAM, 然后将结合反应体系在37℃静置孵育30 min，用2%的琼脂糖凝胶低温电泳100 V，60 min后，在化学发光成像分析仪(GE ImageQuantLAS4000)上用荧光通道检测样本条带。实验结果表明，Sp-dCas9 + sgRNA + target dsDNA-FAM泳道电泳跑胶迁移速率较慢，说明Sp-dCas9在sgRNA的引导下特异地识别并结合了target dsDNA。此外，还可以用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)对Sp-dCas9与target DNA的结合进行检测。
图1: Sp-dCas9在sgRNA的引导下特异地识别并结合target dsDNA
常见问题解答
Q1: dCas9与Cas9有什么区别？
A1: Cas9可识别并剪切dsDNA靶标，其机制涉及HNH和RuvC两个结构域，HNH剪切TS链，RuvC剪切NTS链，两者共同产生dsDNA双链断裂(DSBs)，产生平末端。但dCas9由于H840A和D10A氨基酸突变，导致HNH和RuvC结构域失活，只能结合靶标dsDNA，而不能切割靶标dsDNA。此外，还有nCas9，由于D10A突变导致RuvC结构域失活，nCas9结合dsDNA后只能剪切其中的一条链形成切口。
Q2: Sp-dCas9的sgRNA应该如何设计？
A2: Sp-dCas9的sgRNA可参照以下序列设计：
5′–NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG–3′,（下划线表示与特异靶标序列互补配对的spacer区)。
Q3：#32101、#32102、#32120、#32121这四种Cas9蛋白有什么区别？
A3：SpCas9（#32101）是来源于S. pyogenes菌株的野生型Cas9蛋白。SpCas9 H840A（#32120）是在SpCas9的基础上，H840被突变为A，从而使其HNH结构域失活，因此只有RuvC结构域有剪切活性，仅剪切靶标dsDNA中的NTS链，形成单链缺刻。SpCas9 D10A（#32121）是在SpCas9的基础上，D10被突变为A，从而使其RuvC结构域失活，因此只有HNH结构域有剪切活性，仅剪切靶标dsDNA中的TS链，形成单链缺刻。Sp-dCas9 （#32102）是在SpCas9的基础上，H840和D10都被突变为A，从而使其HNH和RuvC功能域都失活，因此只有结合靶标DNA的活性，而没有切割靶标DNA的活性。
Q4：#32101、#32102、#32120、#32121能应用于基因编辑？
A4：真核细胞基因编辑需要核定位信号（NLS），而目前提供的四种Cas9蛋白均不含NLS，因此只能用于体外检测或原核细胞的基因编辑，而不能用于真核细胞的核基因编辑。
Q5：顺式切割和反式切割的区别？
A5：Cas蛋白对被识别的靶标进行的剪切称为顺式剪切；Cas蛋白在识别到靶标后，对其他核酸进行的无差别剪切被称为反式剪切。在之前的研究中发现，Cas9不具备（或仅有极低的）反式剪切活性，因此，Cas9更适用于基因编辑。
Q6：Cas蛋白的摩尔数与质量如何换算？
A6：
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产品名称 |
相对分子量 |
产品货号 |
规格 |
分子质量 |
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AsCas12a (Cpf1) |
155.0 kDa |
32104-01 |
100 pmol |
15.5 μg |
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32104-03 |
1,000 pmol |
155.0 μg |
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FnCas12a (Cpf1) |
151.9 kDa |
32106-01 |
100 pmol |
15.19 μg |
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32106-03 |
1,000 pmol |
151.9 μg |
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Lb5Cas12a (Cpf1) |
144.7 kDa |
32110-01 |
100 pmol |
14.47 μg |
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32110-03 |
1,000 pmol |
144.7 μg |
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LbCas12a (Cpf1) |
146.9 kDa |
32108-01 |
100 pmol |
14.69 μg |
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32108-03 |
1,000 pmol |
146.9 μg |
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AapCas12b (C2c1) |
133.7 kDa |
32118-01 |
100 pmol |
13.37 μg |
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32118-03 |
1,000 pmol |
133.7 μg |
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AacCas12b (C2c1) |
134.0 kDa |
32116-01 |
100 pmol |
13.4 μg |
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32116-03 |
1,000 pmol |
134.0 μg |
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Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
64.9 kDa |
32119-01 |
100 pmol |
6.49 μg |
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32119-03 |
1,000 pmol |
64.9 μg |
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LwaCas13a (C2c2) |
140.8 kDa |
32117-01 |
100 pmol |
14.08 μg |
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32117-03 |
1,000 pmol |
140.8 μg |
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SpCas9 |
161.4 kDa |
32101-01 |
100 pmol |
16.14 μg |
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32101-03 |
1,000 pmol |
161.4 μg |
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Sp-dCas9 |
159.4 kDa |
32102-01 |
100 pmol |
15.94 μg |
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32102-03 |
1,000 pmol |
159.4 μg |
Q7：顺式剪切实验的注意事项?
A7：顺式剪切实验，跑电泳前需要高温灭活，使Cas蛋白与核酸脱离。不建议使用高浓度的PAGE胶，蛋白容易将核酸堵在上样孔。另外，由于相同摩尔数的情况下，越长的片段，质量越大，因此顺式剪切后条带变暗是正常现象。
参考文献
COA查询
