32119 Un1Cas12f1 (Cas14a) Nuclease
产品概述
■ 产品简介
Un1Cas12f1(又名Cas14a)是一种内切核酸酶，其在tracrRNA:crRNA(或sgRNA)的引导下，特异结合并切割靶标ssDNA，且不受PAM位点的限制。此外，Un1Cas12f1也能以PAM依赖的方式特异地剪切靶标双链DNA，使DNA双链断裂并生成粘性末端。与其他Cas12蛋白类似，当Un1Cas12f1蛋白与sgRNA、靶标DNA结合形成三元复合物后，能启动针对非特异序列ssDNA的剪切，将体系中的任意序列ssDNA切碎。
相比于其他的Cas蛋白，Cas12f1蛋白的分子量普遍较小(400~700 AA)，其中Un1Cas12f1的分子量约61.5 kD。
■ 产品组成
| 组分 | 32119-01 (100 pmol) | 32119-03 (1,000 pmol) |
 Un1Cas12f1 Nuclease (10 μM) a |
100 pmol | 1000 pmol |
 10 × HOLMES Buffer for Cas12f |
1 mL | 1 mL |
a. Un1Cas12f1 Nuclease浓度为10 μM，即10 pmol/μL，100 pmol规格的总体积为10 μL，1,000 pmol规格的总体积为100 μL；
■ 保存条件
-20℃储存。
■ 活性定义
在总体积为20 μL的1 × HOLMES Buffer for Cas12f [pH 8.5]反应体系中，37℃反应条件下，1 min内切割1 pmol ssDNA探针所需的Cas12f酶量定义为1 transU。
■ 实验流程
1. 推荐反应体系
| 组分 | 体积 | 终浓度 |
| 10 × HOLMES Buffer for Cas12f | 2 μL | 1 × |
| 10 µM Un1Cas12f1 Nuclease | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
| 10 μM sgRNA | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
| 1 μM Target DNA b | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
| 10 µM ssDNA Reporter (#31101) | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
| Nuclease-free water | Up to 20 μL |
b. 体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。
● 体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整，用量较少时可先将各组分稀释后加入体系，Un1Cas12f1 Nuclease可用1× HOLMES Buffer for Cas12f稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的Cas12酶长期保存，请使用Cas12 Dilution Buffer，#32012），sgRNA、Target DNA及ssDNA Reporter可用Nuclease-free Water稀释，但极低浓度的Target DNA（例如LOD实验）建议用0.1% Tween 20稀释并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。
实时荧光定量PCR仪记录荧光信号，37℃反应，每30 sec采集一次荧光信号。
常见问题解答
Q1: 常见的Cas12f酶有哪些？它们和Cas12a、Cas12b家族有什么区别？
A1: 除了研究最多的Un1Cas12f1，还有Un2Cas12f1、PtCas12f1、AsCas12f1、RuCas12f1、SpCas12f1、CnCas12f1、Mi1Cas12f2、Mi2Cas12f2、AuCas12f2等，这些Cas12f均识别富含T的PAM序列。总的来说，Cas12f蛋白仅有400-700个氨基酸(aa)，大约是之前已知的Class II CRISPR-Cas酶(950-1400 aa)的一半大小。Cas12f需要crRNA和tracrRNA共同引导(或融合后的sgRNA单独引导)，一开始Jennifer Doudna团队的研究表明，Un1Cas12f1只能识别和切割ssDNA靶标(详细信息请参考PMID: 30337455)；然而Virginijus Siksnys团队的研究成果则证明，Un1Cas12f1同样具有PAM依赖型dsDNA靶标的识别和切割能力，且不同Cas12f的PAM序列稍有不同，但均富含T(详细信息请参考PMID: 32246713)。此外，dsDNA靶标和ssDNA靶标均能激活Cas12f的反式剪切活性，可非特异性剪切体系中的ssDNA探针。详细对比如下表：
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Cas12a(Cpf1) |
Cas12b (C2c1) |
Cas12f (Cas14) |
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Classification |
Class II Type V |
Class II Type V |
Class II Type V |
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Nuclease Domains |
RuvC only |
RuvC only |
RuvC only |
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Guide RNA |
crRNA only |
crRNA and tracrRNA |
crRNA and tracrRNA |
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PAM Sequence |
5´-TTTN-3´ or 5´-TTN-3´ |
5´-TTN-3´ |
T-Rich |
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Cis-Cleavage Target |
dsDNA with PAM or ssDNA |
dsDNA with PAM or ssDNA |
dsDNA with PAM or ssDNA |
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Cis-Cleavage Site of dsDNA |
~14/18-23 bp 3´ of the PAM |
~17-24 bp 3´ of the PAM |
~20-24 bp 3’ of the PAM |
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Cis-Cleavage Site of ssDNA |
~22 nt from the first 3´ guide-complementary base |
/ |
beyond the guide-complementary region |
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Termini of Cis-Cleavage Products |
5´ overhang |
5´ overhang |
5´ overhang |
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Trans-Cleavage Target |
ssDNA |
ssDNA |
ssDNA |
Q2: 如何设计Un1Cas12f1的sgRNA？
A2: Un1Cas12f1的sgRNA可参照以下序列设计：
5′–CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUUUCCUCUCCAAUUCUGCACAAGAAAGUUGCAGAACCCGAAUAGACGAAUGAAGGAAUGCAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3′,（黑色代表tracrRNA区，灰色代表linker区，蓝色代表crRNA区，字体加粗标示tracrRNA的anti-repeat区和crRNA的repeat区；蓝色下划线表示crRNA与特异靶标序列互补配对的spacer区，建议spacer区长度为20～25 nt)。
Q3: Un1Cas12f1对反应环境有什么要求？
A3: Un1Cas12f1的剪切反应体系依赖Mg2+，在37～50℃范围内均有剪切活性。已有研究表明Cas12f 1需要低盐浓度(5～25 mM)的环境，在100～150 mM NaCl反应体系中没有高效的剪切活性。
Q4: 从结构角度上来说，Un1Cas12f1有什么特点？
A4: 已有研究从结构角度剖析Cas12f蛋白的作用过程和机制，值得注意的有两点：1)是Cas12f以二聚体的形式工作，即两个Cas12f结合同1个sgRNA；2)是从结构的角度Cas12f蛋白与核酸链的结合能力较弱。
Q5: Un1Cas12f1对单链DNA靶标的剪切位点在哪里？
A5: Un1Cas12f1对单链DNA靶标的剪切位点超出了与crRNA互补配对的区域，大约在距第一个与 crRNA引导序列配对的3'-碱基的第22位附近(21st-23th)。
Q6: Un1Cas12f1对双链DNA靶标的剪切位点在哪里？取决于什么？
A6: Cas12f家族都识别富含T的PAM序列，但不同来源的Cas12f识别的PAM序列稍有区别，例如Un1Cas12f1识别5′-TTTN-3′, 且对双链DNA靶标的剪切位点取决于PAM序列；对质粒dsDNA靶标的剪切位点在非靶标链(NTS)距PAM第20～22位，和靶标链(TS)距PAM第24位附近，交错剪切，并产生5′悬垂。
Q7: dsDNA靶标和ssDNA靶标均能激活Un1Cas12f1的反式剪切活性吗？
A7: 是的，dsDNA靶标和ssDNA靶标均能激活Un1Cas12f1的反式剪切活性。
参考文献
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