32117 LwaCas13a (C2c2) Nuclease
产品概述
■ 产品简介
LwaCas13a(又名C2c2)核酸酶是依赖于crRNA介导的RNA内切核酸酶，来源于Leptotrichia wadei菌株。在靶标单链RNA存在PFS序列的情况下，可特异地识别并剪切靶标RNA。此外，当LwaCas13a蛋白与crRNA、靶标RNA结合形成三元复合物后，能启动针对非特异序列单链RNA的剪切，将体系中的任意序列单链RNA切碎。
■ 产品组成
| 组分 | 32117-01 (100 pmol) | 32117-03 (1,000 pmol) |
 LwaCas13a Nuclease (10 μM) a |
100 pmol | 1,000 pmol |
 10 × HOLMES Buffer for Cas13a |
1 mL | 1 mL |
a. LwaCas13a Nuclease浓度为10 μM，即10 pmol/μL，100 pmol规格的总体积为10 μL，1,000 pmol规格的总体积为100 μL；
■ 保存条件
-20℃储存。
■ 活性定义
在总体积为20 μL的1 × HOLMES Buffer for Cas13a [pH 7.6]反应体系中，37℃反应条件下，1 min内剪切1 pmol ssRNA探针所需的Cas13a酶量定义为1 transU。
■ 实验流程
1. 推荐反应体系
| 组分 | 体积 | 终浓度 |
| 10 × HOLMES Buffer for Cas13a | 2 μL | 1 × |
| 10 μM LwaCas13a Nuclease | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
| 10 μM crRNA | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
| 10 μM Target RNA | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
| 10 μM ssRNA Reporter (FAM-BHQ1) | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
| Nuclease-free water | Up to 20 μL |
● 体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整，用量较少时可先将各组分稀释后加入体系，LwaCas13a Nuclease可用1×HOLMES Buffer for Cas13a稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的Cas13酶长期保存，请使用Cas13 Dilution Buffer，#32013），crRNA、Target RNA及ssRNA Reporter可用Nuclease-free Water稀释，但极低浓度的Target RNA（例如LOD实验）建议用0.1% Tween 20稀释并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。
实时荧光定量PCR仪记录荧光信号，37℃反应，每30 sec采集一次荧光信号。
■ 实验结果
Fig 1. Results of Cas13-mediated cleavage of ssRNA Reporters under different concentrations of target RNA.
常见问题解答
Q1: 常见的Cas13酶有哪些？它们和Cas12、Cas9家族有什么区别？
A1: 常见的Cas13包括Cas13a、Cas13b、Cas13c等，其中Cas13a/Cas13c的spacer区在crRNA的3'端，例如LwaCas13a；而Cas13b的spacer区在crRNA的5'端，例如PsmCas13b。总的来说，Cas13蛋白只需要crRNA单独引导，识别并剪切靶标ssRNA。此外，ssRNA靶标能激活Cas13的反式剪切活性，可非特异性剪切体系中的ssRNA探针。详细对比如下表：
|
|
Cas9 |
Cas12 |
Cas13 |
|
Classification |
Class II Type II |
Class II Type V |
Class II Type VI |
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Nuclease Domains |
RuvC and HNH |
RuvC only |
HEPN × 2 |
|
Guide RNA |
crRNA and tracrRNA |
crRNA only or |
crRNA only |
|
PAM Sequence |
5´-NGG-3´ |
T-Rich |
/ |
|
Cis-Cleavage Target |
dsDNA with PAM |
dsDNA with PAM or ssDNA |
ssRNA |
|
Trans-Cleavage Target |
/ |
ssDNA |
ssRNA |
Q2: 如何设计LwaCas13a的crRNA？
A2: LwaCas13a的crRNA可参照以下序列设计：
5′–GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3′,（黑色代表direct repeat区，蓝色下划线标示crRNA与特异靶标序列互补配对的spacer区，建议spacer区长度为28 nt)。
参考文献
COA查询
