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32101 SpCas9 Nuclease

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32101 SpCas9 Nuclease

  • 规 格:
    • 100 pmoL
    • 1,000 pmoL

货 号:

32101-01


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产品概述

产品描述

SpCas9来源于S. pyogenes菌株,是依赖于crRNA和tracrRNA(或连接后形成的sgRNA)引导的DNA内切核酸酶,在靶标双链DNA存在PAM(NGG)的情况下,特异地剪切靶标双链DNA,使DNA双链断裂并生成平末端。PAM对于Cas9的识别和剪切都是必需的,其剪切位点位于目标序列(target sequence)内,离PAM区3个碱基。此外,在PAMmer序列存在时,SpCas9也能特异地剪切单链DNA或RNA(详细信息请参考PMID: 24476820;PMID: 25274302)。此酶还可应用于体外靶标DNA的剪切、目的片段的克隆等实验(详细信息可参考PMID: 26323354) 。

 

 

产品组分

组分

32101-01(100 pmol) 

32101-03(1,000 pmol) 

 SpCas9 Nuclease (10 μM) a

100 pmol 1,000 pmol

 10 × TOLO Buffer 3

1 mL 1 mL

a. SpCas9 Nuclease 浓度为 10 μM,即 10 pmol/μL,100 pmol 规格的总体积为 10 μL,1,000 pmol 规格的总体积为 100 μL;

 

 

保存条件

组分-20℃储存;≤ 0℃运输。

 

 

产品优势

✽ 高纯度

✽ 高灵敏度

✽ 高特异性

 

 

实验案例

1.SpCas9的顺式剪切:本实验中使用小鼠来源的DNMT1基因的部分片段作为靶标,靶标双链DNA总长度为2.2 kb,实验中设计的sgRNA包含与DNMT1序列互补的spacer区。实验结果表明,SpCas9在sgRNA的引导下特异识别并剪切DNMT1序列,导致靶标DNA双链断裂,得到2段顺式剪切产物,片段大小分别为1.3 kb 和0.9 kb。

图1:SpCas9的顺式剪切活性

 

 

实验流程

1.顺式剪切实验

组分

体积 

终浓度 

10 × TOLO Buffer 3

2 μL 1 ×

10 μM SpCas9 Nuclease

0.5 μL 250 nM

10 μM sgRNA

0.5 μL 250 nM

1 μM Target dsDNA

0.5 μL 25 nM

Nuclease-free water

Up to 20 μL  

◆ 若用核酸电泳来分析顺式剪切产物,对于20 μL顺式剪切应体系,推荐target DNA的使用量为100 ng~500 ng,且target DNA片段长度在300 bp~3 kb范围内。不同长度target DNA需要的Cas酶和sgRNA的量需要根据target DNA的摩尔量计算,建议保持Cas酶:sgRNA:target DNA的摩尔比为10:10:1,以尽量确保target DNA被剪切完全。

◆ 37℃反应30 min~1 h,85℃灭活5 min。核酸电泳分析顺式剪切产物。

 

常见问题解答

Q1: Cas9与Cas12、Cas13有什么区别?

A1: Cas9与Cas12和Cas13相比最主要的区别是,Cas12与guide RNA、target DNA结合后会被激发针对ssDNA的反式剪切活性;Cas13与guide RNA、target RNA结合后会被激发针对ssRNA的反式剪切活性;而Cas9暂未被报道反式剪切活性。详细对比如下表:

 

Cas9

Cas12

Cas13

Classification

Class II Type II

Class II Type V

Class II Type VI

Nuclease Domains

RuvC and HNH

RuvC only

HEPN × 2

Guide RNA

crRNA and tracrRNA

crRNA only or

crRNA and tracrRNA

crRNA only

PAM Sequence

5´-NGG-3´

T-Rich

/

Cis-Cleavage Target

dsDNA with PAM

dsDNA with PAM or ssDNA

ssRNA

Trans-Cleavage Target

/

ssDNA

ssRNA

 

Q2: SpCas9的sgRNA应该如何设计?

A2: SpCas9的sgRNA可参照以下序列设计:
5′–NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG–3′,(下划线表示与特异靶标序列互补配对的spacer区)。

 

Q3: Cas9剪切dsDNA靶标的结构域有何特征吗?

A3: Cas9是一种双RNA引导的核酸内切酶,同时需要crRNA和tracrRNA(或工程化改造的融合sgRNA)进行靶标dsDNA的识别和切割,其机制涉及RuvC和HNH两个结构域,其中RuvC剪切NTS链,HNH剪切TS链,两者共同产生dsDNA断裂(DSBs),形成平末端,剪切位点在靶标dsDNA序列PAM 5´端的3 bp处。

 

Q4: Cas9只能识别并剪切带PAM的dsDNA靶标吗?

A4: 不是,Cas9家族也分为A、B、C亚型,其中C亚型的Cas9被证明更倾向于剪切ssDNA靶标。此外,在PAMmer存在的情况下,Cas9还能剪切ssRNA靶标。

 

Q5: 顺式剪切体系Cas9酶:sgRNA:target DNA为什么要保持10:10:1的摩尔比?

A5: 为了使靶标dsDNA被剪切完全,常规建议Cas9酶:sgRNA:target DNA=10:10:1。当sgRNA利用效率不高时,建议尝试Cas9酶:sgRNA=1:1.25~2。

 

Q6: 本试剂盒中的Control Target DNA and sgRNA既可用于顺式剪切体系的对照,又可用于反式剪切体系的对照吗?

A6: 不是,SpCas9试剂盒中提供的Control Target DNA and sgRNA仅可用于顺式剪切。

 

 

产品说明书

#32101 SpCas9 Nuclease Manual

pdf

713.2KB

参考文献

COA查询

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