Q1: Cas9与Cas12、Cas13有什么区别？

A1: Cas9与Cas12和Cas13相比最主要的区别是，Cas12与guide RNA、target DNA结合后会被激发针对ssDNA的反式剪切活性；Cas13与guide RNA、target RNA结合后会被激发针对ssRNA的反式剪切活性；而Cas9暂未被报道反式剪切活性。详细对比如下表：

Q2: SpCas9的sgRNA应该如何设计？

A2: SpCas9的sgRNA可参照以下序列设计：
5′-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG–3′,（下划线表示与特异靶标序列互补配对的spacer区)。

Q3: Cas9剪切dsDNA靶标的结构域有何特征吗？

A3: Cas9是一种双RNA引导的核酸内切酶，同时需要crRNA和tracrRNA（或工程化改造的融合sgRNA）进行靶标dsDNA的识别和切割，其机制涉及RuvC和HNH两个结构域，其中RuvC剪切NTS链，HNH剪切TS链，两者共同产生dsDNA断裂(DSBs)，形成平末端，剪切位点在靶标dsDNA序列PAM 5´端的3 bp处。

Q4: Cas9只能识别并剪切带PAM的dsDNA靶标吗？

A4: 不是，Cas9家族也分为A、B、C亚型，其中C亚型的Cas9被证明更倾向于剪切ssDNA靶标。此外，在PAMmer存在的情况下，Cas9还能剪切ssRNA靶标。

Q5: 顺式剪切体系Cas9酶:sgRNA:target DNA为什么要保持10:10:1的摩尔比？

A5: 为了使靶标dsDNA被剪切完全，常规建议Cas9酶:sgRNA:target DNA=10:10:1。当sgRNA利用效率不高时，建议尝试Cas9酶:sgRNA=1:1.25～2。

Q6：#32101、#32102、#32120、#32121这四种Cas9蛋白有什么区别？

A6：SpCas9（#32101）是来源于S. pyogenes菌株的野生型Cas9蛋白。SpCas9 H840A（#32120）是在SpCas9的基础上，H840被突变为A，从而使其HNH结构域失活，因此只有RuvC结构域有剪切活性，仅剪切靶标dsDNA中的NTS链，形成单链缺刻。SpCas9 D10A（#32121）是在SpCas9的基础上，D10被突变为A，从而使其RuvC结构域失活，因此只有HNH结构域有剪切活性，仅剪切靶标dsDNA中的TS链，形成单链缺刻。Sp-dCas9 （#32102）是在SpCas9的基础上，H840和D10都被突变为A，从而使其HNH和RuvC功能域都失活，因此只有结合靶标DNA的活性，而没有切割靶标DNA的活性。

Q7：#32101、#32102、#32120、#32121能应用于基因编辑？

A7：真核细胞基因编辑需要核定位信号（NLS），而目前提供的四种Cas9蛋白均不含NLS，因此只能用于体外检测或原核细胞的基因编辑，而不能用于真核细胞的核基因编辑。

Q8：顺式切割和反式切割的区别？

A8：Cas蛋白对被识别的靶标进行的剪切称为顺式剪切；Cas蛋白在识别到靶标后，对其他核酸进行的无差别剪切被称为反式剪切。在之前的研究中发现，Cas9不具备（或仅有极低的）反式剪切活性，因此，Cas9更适用于基因编辑。

Q9：Cas蛋白的摩尔数与质量如何换算？

A9：

Q10：顺式剪切实验的注意事项?

A10：顺式剪切实验，跑电泳前需要高温灭活，使Cas蛋白与核酸脱离。不建议使用高浓度的PAGE胶，蛋白容易将核酸堵在上样孔。另外，由于相同摩尔数的情况下，越长的片段，质量越大，因此顺式剪切后条带变暗是正常现象。