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32101 SpCas9 Nuclease

规格：
- 100 pmoL
- 1,000 pmoL

货号：

32101-01

价格：

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产品概述

产品描述

SpCas9来源于S. pyogenes菌株，是依赖于crRNA和tracrRNA(或连接后形成的sgRNA)引导的DNA内切核酸酶，在靶标双链DNA存在PAM(NGG)的情况下，特异地剪切靶标双链DNA，使DNA双链断裂并生成平末端。PAM对于Cas9的识别和剪切都是必需的，其剪切位点位于目标序列(target sequence)内，离PAM区3个碱基。此外，在PAMmer序列存在时，SpCas9也能特异地剪切单链DNA或RNA(详细信息请参考PMID: 24476820；PMID: 25274302)。此酶还可应用于体外靶标DNA的剪切、目的片段的克隆等实验(详细信息可参考PMID: 26323354) 。

产品组分

组分	32101-01（100 pmol）	32101-03（1,000 pmol）
SpCas9 Nuclease (10 μM) ^a	100 pmol	1,000 pmol
10 × TOLO Buffer 3	1 mL	1 mL
Control Target DNA and sgRNA ^b	5 μL	5 μL

a. SpCas9 Nuclease 浓度为 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 规格的总体积为 10 μL，1,000 pmol 规格的总体积为 100 μL；

b. Control Target DNA and sgRNA 应保存于-80℃并避免反复冻融，必须在 6 个月内使用，使用时建议取 0.5 μL 至每 20 μL 反应体系。

保存条件

Control Target DNA and sgRNA 于-80℃储存，其余组分-20℃储存；≤ 0℃运输。

产品优势

✽ 高纯度

✽ 高灵敏度

✽ 高特异性

实验案例

1.SpCas9的顺式剪切：本实验中使用小鼠来源的DNMT1基因的部分片段作为靶标，靶标双链DNA总长度为2.2 kb，实验中设计的sgRNA包含与DNMT1序列互补的spacer区。实验结果表明，SpCas9在sgRNA的引导下特异识别并剪切DNMT1序列，导致靶标DNA双链断裂，得到2段顺式剪切产物，片段大小分别为1.3 kb 和0.9 kb。

图1:SpCas9的顺式剪切活性

实验流程

1.顺式剪切实验

组分	体积	终浓度
10 × TOLO Buffer 3	2 μL	1 ×
10 μM SpCas9 Nuclease	0.5 μL	250 nM
10 μM sgRNA	0.5 μL	250 nM
1 μM Target dsDNA	0.5 μL	25 nM
Nuclease-free water	Up to 20 μL

◆ 若用核酸电泳来分析顺式剪切产物，对于20 μL顺式剪切应体系，推荐target DNA的使用量为100 ng～500 ng，且target DNA片段长度在300 bp～3 kb范围内。不同长度target DNA需要的Cas酶和sgRNA的量需要根据target DNA的摩尔量计算，建议保持Cas酶:sgRNA:target DNA的摩尔比为10:10:1，以尽量确保target DNA被剪切完全。

◆ 37℃反应30 min~1 h，85℃灭活5 min。核酸电泳分析顺式剪切产物。

常见问题解答

Q1: Cas9与Cas12、Cas13有什么区别？

A1: Cas9与Cas12和Cas13相比最主要的区别是，Cas12与guide RNA、target DNA结合后会被激发针对ssDNA的反式剪切活性；Cas13与guide RNA、target RNA结合后会被激发针对ssRNA的反式剪切活性；而Cas9暂未被报道反式剪切活性。详细对比如下表：

	Cas9	Cas12	Cas13
Classification	Class II Type II	Class II Type V	Class II Type VI
Nuclease Domains	RuvC and HNH	RuvC only	HEPN × 2
Guide RNA	crRNA and tracrRNA	crRNA only or crRNA and tracrRNA	crRNA only
PAM Sequence	5´-NGG-3´	T-Rich	/
Cis-Cleavage Target	dsDNA with PAM	dsDNA with PAM or ssDNA	ssRNA
*Trans-Cleavage* Target	/	ssDNA	ssRNA

Q2: SpCas9的sgRNA应该如何设计？

A2: SpCas9的sgRNA可参照以下序列设计：
5′–NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG–3′,（下划线表示与特异靶标序列互补配对的spacer区)。

Q3: Cas9剪切dsDNA靶标的结构域有何特征吗？

A3: Cas9是一种双RNA引导的核酸内切酶，同时需要crRNA和tracrRNA（或工程化改造的融合sgRNA）进行靶标dsDNA的识别和切割，其机制涉及RuvC和HNH两个结构域，其中RuvC剪切NTS链，HNH剪切TS链，两者共同产生dsDNA断裂(DSBs)，形成平末端，剪切位点在靶标dsDNA序列PAM 5´端的3 bp处。