3
ph
%{tishi_zhanwei}%

31902 Cas9 High Yield sgRNA Synthesis and Purification Kit

  • 31902(1).png
  • 3620F.png

31902 Cas9 High Yield sgRNA Synthesis and Purification Kit

  • 规 格:
    • 25 T
    • 50 T

货 号:

31902-01


价 格:

¥ 0

¥ 2300


联系经销商

*具体价格咨询当地经销商

隐藏域元素占位

产品概述

产品描述

Cas9 High Yield sgRNA Synthesis and Purification Kit 是基于 T7 RNA 聚合酶的体外 RNA 转录试剂盒,可高效进行 Cas9 sgRNA 的制备。使用本试剂盒时,仅需按照本试剂盒说明书设计并合成 Target Sense Oligo,每次反应可获得 50-150 μg 的 Cas9 sgRNA。获得的 Cas9 sgRNA 可应用于 CRISPR 分子诊断、基因编辑等。

 

 

产品组分

Part A:体外转录试剂(-20℃保存)

31902-01(25 T) 

31902-02(50 T) 

 5 × TranscriptMax Reaction Buffer

100 μL 200 μL

 NTP mix

200 μL 400 μL

 TranscriptMax Enzyme Mix 

55 μL 110 μL

○ Nuclease-free Water 

1 mL 1 mL

 2 × PCR Master Mix

250 μL 500 μL

 Cas9 Antisense Oligo

25 μL 25 μL

 Cas9 Control Target Sense Oligo a 

25 μL 25 μL

 2 × DNase Ⅰ Buffer

625 μL 1250 μL

 DNase Ⅰ 

100 μL 200 μL

Part B:纯化磁珠(4℃保存)

3620F-01(25 T) 

3620F-02(50 T) 

 Magnetic Beads b

625 μL 1250 μL

a. Cas9 Control Target Sense Oligo 是阳性对照,可与 Cas9 Antisense Oligo 退火延伸后,作为转录模板使用,用来测试体外转录体系的效率。在 37℃孵育 30 min 条件下,对照转录反应体系生成的 sgRNA 产量≥50 μg,其产量在纯化后由NanoDrop 测定。在变性条件下进行 TBE-Urea gel 电泳,可观察到 sgRNA 单条带大小约为 100 nt。

b. 本产品中 Part B 组分(纯化磁珠,#3620F)与 Part A 组分保存条件不同,因此 Part B 组分需单独运输!

 

 

保存条件

Part A 组分-20℃保存,有效期 1 年。

 

 

需自备的实验物品

  • PCR 仪
  • 无水乙醇
  • 异丙醇
  • 无核酸酶水
  • 96 孔磁力架
  • 96 孔板或 PCR 8 联排管
  • 移液器及吸头

 

 

Cas9 sgRNA 转录引物设计

1.Cas9 sgRNA 转录原理示意图

Cas9 sgRNA 转录原理示意图如图 1 所示,试剂盒中已提供 Cas9 Antisense Oligo,只需根据待测目标序列设计 Target Sense Oligo 即可。

图 1. Cas9 sgRNA 转录原理示意图

 

2.Target Sense Oligo 设计举例

2.1 选取 20 bp 的 Target Sequence,其中方框部分为 PAM 序列,下划线部分为 Target Sequence。

 

2.2 根据选取的 Target Sequence 设计 Target Sense Oligo,则其序列应为:

其中双下划线为保护碱基,波浪线部分为 T7 Promoter 序列,下划线部分为 Target Sequence反向互补序列,如果 Target Sequence 反向互补序列第一个字母是 G 碱基,则可以和 T7 Promoter 序列共用一个 G 碱基。下划虚线部分为 SpCas9 sgRNA Scaffold 部分序列。

 

2.3 转录得到的 Cas9 sgRNA 序列应为:

下划线部分为 Target Sequence反向互补序列,波浪线部分为 SpCas9 sgRNA Scaffold 部分序列。

 

 

实验流程

1.DNA 转录模板制备

Cas9 Antisense Oligo 与 Target Sense Oligo 退火延伸反应完成后便可作为转录模板使用。

1.1 退火体系配制

组分

体积 

2 × PCR Master Mix

10 μL

Cas9 Antisense Oligo (10μM)

0.5 μL

Target Sense Oligo (10μM) 

0.5 μL

DEPC-treated Water 

9 μL

1.2 PCR 退火延伸程序设置

温度

时间 

循环数

95℃

2 min × 1

95℃

15 s × 5

55℃ 

15 s

72℃ 

10 s

25℃ 

Hold on  

 

2.Cas9 sgRNA 体外转录

2.1 按下表试剂的顺序进行反应体系的配制。

组分

体积 

5 × TranscriptMax Reaction Buffer

4 μL

NTP mix

8 μL

TranscriptMax Enzyme Mix 

2.1 μL

DEPC-treated Water 

0.9 μL

DNA 转录模板

5 μL

· 请将试剂解冻并完全混匀后再使用。

· 5 × TranscriptMax Reaction Buffer 中含有亚精胺,而亚精胺与核酸容易形成复合体沉淀,DNA 转录模板尽量最后加入到体系中。

· 上述反应体系的总体积为 20 μL,可适当等比例调整反应体系。

2.2 将上述试剂充分混匀,然后短暂离心,在 37°C下孵育 2-4 h 进行体外转录,延长转录时间可提高转录产量。在时间充裕的条件下,推荐过夜转录 12-16 h。

2.3 37℃孵育结束后,按照下表配制 30 μL 的 DNase Ⅰ反应液加入到 20 μL 的体外转录产物中,以去除转录体系中的 DNA 模板。

组分

体积 

2 × DNase Ⅰ Buffer

25 μL

DNase Ⅰ

4 μL

DEPC-treated Water 

1 μL

DNase Ⅰ反应条件:37℃,30 min。

 

3.Cas9 sgRNA 转录产物磁珠纯化

3.1 首先将磁珠从 4℃冰箱中取出,在室温中放置约 30 min,使其温度平衡至室温。颠倒或涡旋振荡使磁珠充分混匀,吸取 25 μL 磁珠和 50 μL 异丙醇加入到 50 μL 待纯化的 sgRNA 样品中,用移液器吹打充分混匀。

3.2 室温孵育 5 min,使 RNA 结合到磁珠上。

3.3 将样品置于磁力架上 5 min,待溶液澄清后,小心移除上清。

3.4 保持样品置于磁力架上,加入 200 μL 新鲜配制的 80%乙醇,漂洗磁珠,室温孵育 30 s,小心移除上清。

注:漂洗时使用的 80% (v/v)乙醇需要使用 Nuclease-free water 新鲜配制,配制方法举例如下:分别量取8 mL 无水乙醇和 2 mL Nuclease-free water,混匀后可得 10 mL 80% (v/v)乙醇。

3.5 重复步骤 4,共漂洗 2 次。

3.6 保持样品始终处于磁力架上,开盖空气干燥磁珠 5 min。

注:磁珠开盖晾干时要避免过分干燥,如果磁珠出现龟裂,则提示磁珠过分干燥,此时 RNA 的洗脱效率会降低。

3.7 将样品从磁力架上取出,加入 50 μL Nuclease-free water,用移液器吹打以充分混匀,室温静置 5 min。

3.8 将样品置于磁力架 5 min,待溶液澄清后,小心转移上清至一个新的 Nuclease-free PCR 管中,即得到纯化后的 Cas9 sgRNA。

3.9 将纯化后的sgRNA于70℃处理10 min,以灭活残留的DNase I。

 

 

注意事项

1. 本试剂盒制备的 sgRNA 为目前最常用的 SpCas9 sgRNA,如果要制备其它类型的 Cas9 sgRNA,只需要根据 Cas9 sgRNA scaffold 序列重新设计 Target Sense Oligo 与 Cas9 Antisense Oligo 即可。

2. 本试剂盒中的 Part B 组分(纯化磁珠,#3620F)单独运输。磁珠保存条件为 2-8℃,严禁冻存和高速离心操作。

3. 转录模板的纯度会显著影响体外转录反应。例如模板 DNA 中混入 RNase、EDTA、NaCl 等高盐溶液均可显著抑制体外转录反应,导致 RNA 合成量减少。

4. 实验过程应选用无核酸酶的枪头和离心管。

常见问题解答

产品说明书

31902 Cas9 High Yield sgRNA Synthesis and Purification Kit-231215-R10

pdf

745.8KB

参考文献

COA查询

%{tishi_zhanwei}%