■ 产品描述

High-yield Cas9 sgRNA Synthesis and Purification Kit是基于T7 RNA聚合酶的体外RNA转录试剂盒，可高效进行Cas9 sgRNA的制备。使用本试剂盒时，仅需按照本试剂盒说明书设计并合成Target Sense Oligo，每次反应可获得50-150 μg的Cas9 sgRNA。

 

■ 产品组分

Part A：体外转录试剂（-20℃保存）	31902-01 (25 T)	31902-02 (50 T)
● 5 × TranscriptMax Reaction Buffer	100 μL	200 μL
● NTP mix	200 μL	400 μL
● TranscriptMax Enzyme Mix	55 μL	110 μL
○ Nuclease-free Water	1 mL	1 mL
● 2 × PCR Master Mix	250 μL	500 μL
● Cas9 Antisense Oligo	25 μL	25 μL
● Cas9 Control Target Sense Oligo a	25 μL	25 μL
● 2 × DNase Ⅰ Buffer	625 μL	1250 μL
● DNase Ⅰ	100 μL	200 μL

Part B：纯化磁珠（4℃保存）	3620F-01 (25 T)	3620F-01 (50 T)
● Magnetic Beads b	625 μL	1250 μL

a. Cas9 Control Target Sense Oligo是阳性对照，可与Cas9 Antisense Oligo退火延伸后，作为转录模板使用，用来测试体外转录体系的效率。在37℃孵育30 min条件下，对照转录反应体系生成的sgRNA产量≥50 μg，其产量在纯化后由NanoDrop测定。在变性条件下进行TBE-Urea gel电泳，可观察到sgRNA单条带大小约为100 nt。

b. 本产品中Part B组分（纯化磁珠，#3620F）与Part A组分保存条件不同，因此Part B组分需单独运输！

 

■ 保存条件

Part A组分-20℃储存；Part B组分2～8℃储存（磁珠严禁冷冻！）。 

 

■ 需自备的实验物品

• PCR仪

• 无水乙醇

• 异丙醇

• 无核酸酶水

• 96 孔磁力架（推荐TOLOBIO 96孔磁力架，货号：#49002）

• 96 孔板或PCR 8联排管

• 移液器及吸头

 

■ Cas9 sgRNA转录引物设计

1.Cas9 sgRNA转录原理示意图

Cas9 sgRNA转录原理示意图如图1所示，试剂盒中已提供Cas9 Antisense Oligo，只需根据待测目标序列设计Target Sense Oligo即可。

 

 

图1. Cas9 sgRNA转录原理示意图

 

2.Target Sense Oligo设计举例

2.1 选取20 bp的Target Sequence，其中方框部分为PAM序列，下划线部分为Target Sequence。

 

2.2 根据选取的Target Sequence设计Target Sense Oligo，则其序列应为：

其中双下划线为保护碱基，波浪线部分为T7 Promoter序列，下划线部分为Target Sequence反向互补序列，如果Target Sequence反向互补序列第一个字母是G碱基，则可以和T7 Promoter序列共用一个G碱基。下划虚线部分为SpCas9 sgRNA Scaffold部分序列。

 

2.3 转录得到的Cas9 sgRNA序列应为：

下划线部分为Target Sequence反向互补序列，波浪线部分为SpCas9 sgRNA Scaffold部分序列。

 

■ 实验流程

1.DNA转录模板制备

Cas9 Antisense Oligo与Target Sense Oligo退火延伸反应完成后便可作为转录模板使用。

1.1 退火延伸体系配制

组分	体积
2 × PCR Master Mix	10 μL
Cas9 Antisense Oligo (10μM)	0.5 μL
Target Sense Oligo (10μM)	0.5 μL
Nuclease-free Water	9 μL

1.2 PCR退火延伸程序设置

温度	时间	循环数
95℃	2 min	× 1
95℃	15 s	× 5
55℃	15 s
72℃	10 s
25℃	Hold on

 

2.Cas9 sgRNA体外转录

2.1 按下表试剂的顺序进行反应体系的配制。

组分	体积
5 × TranscriptMax Reaction Buffer	4 μL
NTP mix	8 μL
TranscriptMax Enzyme Mix	2.1 μL
Nuclease-free Water	0.9 μL
DNA 转录模板	5 μL

• 请将试剂解冻并完全混匀后再使用。

• 5 × TranscriptMax Reaction Buffer中含有亚精胺，而亚精胺与核酸容易形成复合体沉淀，DNA转录模板尽量最后加入到体系中。

• 上述反应体系的总体积为20 μL，可适当等比例调整反应体系。

2.2 将上述试剂充分混匀，然后短暂离心，在37°C下孵育2-4 h进行体外转录，延长转录时间可提高转录产量。在时间充裕的条件下，推荐过夜转录12-16 h。

2.3 37℃孵育结束后，按照下表配制30 μL的DNase Ⅰ应液加入到20 μL的体外转录产物中，以去除转录体系中的DNA模板。

组分	体积
2 × DNase Ⅰ Buffer	25 μL
DNase Ⅰ	4 μL
Nuclease-free Water	1 μL

DNase Ⅰ反应条件：37℃，30 min。

 

3.Cas9 sgRNA转录产物磁珠纯化

3.1 首先将磁珠从4℃冰箱中取出，在室温中放置约30 min，使其温度平衡至室温。颠倒或涡旋振荡使磁珠充分混匀，吸取25 μL磁珠和50 μL异丙醇加入到50 μL待纯化的sgRNA 样品中，用移液器吹打充分混匀。

3.2 室温孵育5 min，使RNA结合到磁珠上。

3.3 将样品置于磁力架上5 min，待溶液澄清后，小心移除上清。

3.4 保持样品置于磁力架上，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇，漂洗磁珠，室温孵育30 s，小心移除上清。

注：漂洗时使用的80% (v/v)乙醇需要使用Nuclease-free water新鲜配制，配制方法举例如下：分别量取8 mL无水乙醇和2 mL Nuclease-free water，混匀后可得10 mL 80% (v/v)乙醇。

3.5 重复步骤4，共漂洗2 次。

3.6 保持样品始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠5 min。

注：磁珠开盖晾干时要避免过分干燥，如果磁珠出现龟裂，则提示磁珠过分干燥，此时RNA的洗脱效率会降低。

3.7 将样品从磁力架上取出，加入50 μL Nuclease-free water，用移液器吹打以充分混匀，室温静置5 min。

3.8 将样品置于磁力架5 min，待溶液澄清后，小心转移上清至一个新的Nuclease-free PCR管中，即得到纯化后的Cas9 sgRNA。

3.9 将纯化后的sgRNA于70℃处理10 min，以灭活残留的DNase I。

 

■ 注意事项

1. 本试剂盒制备的sgRNA为目前最常用的SpCas9 sgRNA，如果要制备其它类型的Cas9 sgRNA，只需要根据Cas9 sgRNA scaffold序列重新设计Target Sense Oligo 与 Cas9 Antisense Oligo即可。

2. 本试剂盒中的Part B 组分（纯化磁珠，货号：#3620F）单独运输。磁珠保存条件为2-8℃，严禁冻存和高速离心操作。

3. 转录模板的纯度会显著影响体外转录反应。例如模板DNA中混入RNase、EDTA、NaCl等高盐溶液均可显著抑制体外转录反应，导致RNA合成量减少。

4. 实验过程应选用无核酸酶的枪头和离心管。