31901 TranscriptMax High-yield T7 RNA Synthesis Kit
产品概述
■ 产品描述
TranscriptMax High-yield T7 RNA Synthesis Kit是基于T7 RNA聚合酶的高效RNA体外转录试剂盒。该试剂盒中含有T7 RNA聚合酶、反应缓冲液、核苷酸混合液等经过优化的试剂，可以将含有 T7启动子的DNA模板高效转录成RNA。本试剂盒可应用于制备guide RNA、RNA标准品等。
■ 产品组分
| 组分 | 31901-01 (25 T) | 31901-02 (50 T) |
 5 × TranscriptMax Reaction Buffer |
100 μL | 200 μL |
 NTP mix |
200 μL | 400 μL |
 TranscriptMax Enzyme Mix |
55 μL | 110 μL |
 Nuclease-free Water |
250 μL | 250 μL |
 Positive Control Template a |
50 μL | 50 μL |
a. Positive Control Template是阳性对照，可作为转录模板使用，用来测试体外转录体系的反应效率。在37℃孵育30 min条件下，对照转录反应体系生成的转录RNA产量≥50 μg，其产量在纯化后由NanoDrop测定。
■ 保存条件
-20℃储存。
■ 实验流程
1. T7 RNA转录原理示意图
T7 RNA转录原理示意图如图1所示。
图1. T7 RNA转录原理示意图
2. DNA转录模板类型
2.1 质粒模板
带有T7启动子的质粒可以作为转录模板，但是质粒必须要线性化，可通过限制性核酸内切酶或PCR扩增的方法将质粒线性化。质粒线性化后，将纯化后的产物作为模板，每个反应体系建议加入1 μg的线性化质粒作为模板进行体外转录。
2.2 PCR产物模板
带有T7启动子的PCR产物可以作为转录模板。需要通过电泳确定PCR产物的特异性和浓度，一般在20 μL的体外转录体系中加入2-5 μL的PCR产物作为模板。
2.3 合成的DNA模板
带有T7启动子的合成DNA片段可以作为转录模板。一般将合成的T7 oligo和T7 oligo反向互补的模板链退火后作为模板，每个反应体系建议加入0.25 μM-1 μM的退火产物作为模板。
3.体外转录反应
3.1 按下表试剂的顺序进行反应体系的配制。
| 组分 | 体积 |
| 5 × TranscriptMax Reaction Buffer | 4 μL |
| NTP mix | 8 μL |
| TranscriptMax Enzyme Mix | 2.1 μL |
| DNA 转录模板 | x μL |
| Nuclease-free Water | Up to 20 μL |
· 请将试剂解冻并完全混匀后再使用。
· 5 × TranscriptMax Reaction Buffer中含有亚精胺，而亚精胺与核酸容易形成复合体沉淀，DNA转录模板尽量最后加入到体系中。
· 上述反应体系的总体积为20 μL，可适当等比例调整反应体系。
3.2 将上述试剂充分混匀，然后短暂离心，在37℃下孵育2-4 h进行体外转录即可获得RNA产物。延长转录时间（如过夜转录12-16 h）可提高RNA产量。
3.3 37℃孵育结束后，后续进行转录产物的纯化推荐使用Tolo RNAclean Kit (Magnetic Beads，货号：#36201) ，该试剂盒具有彻底去除DNA模板残留，操作简便等特点。
常见问题解答
Q1：一次可制备多少量的gRNA？
A1：每次反应可获得50-150 μg，延长转录时间至12-16小时可有效提高产量。
Q2：该试剂盒的原理是什么？
A2：利用两条Oligo退火（延伸）形成带T7启动子的双链DNA转录模板（保证T7启动子区域为双链，允许T7 RNA聚合酶识别），之后进行T7转录，接着用DNase Ⅰ消化去除DNA转录模板（否则会被Cas蛋白视作靶标而识别，造成假阳性），最后磁珠纯化获得高纯度gRNA。
Q3：可以用质粒作为转录模板吗？
A3：不建议。因为质粒做转录模板时，转录的终止位置不非常确定（即便有T7终止子的情况下也是如此），会导致转录产物长短不一。而除Cas9的gRNA以外，其他gRNA识别靶标的区域都在RNA的3’端，对于该位置的序列较为敏感，不准确的转录终止位置会影响Cas蛋白的识别。所以如果要用质粒作为转录模板，建议酶切处理使其线性化。
Q4：RNA体外转录从哪个碱基开始？T7启动子残留的碱基是否会对后续实验造成影响？
A4：转录起始于T7启动子5' – TAATACGACTCACTATAG – 3'的最后一个碱基G，转录产物的第一个碱基为G。常见的Cas12a、Cas12b、Cas12f和Cas13a，其gRNA的spacer区均在3' 端，5' 端多一个G没有影响。对于Cas9和Cas13b等gRNA的spacer区在5’端的情况，仅多一个G也没有显著影响，但如果spacer区的第一个碱基也刚好是G，则可以与T7启动子序列共用一个 G 碱基。
Q5：已知RNA的质量浓度（ng/μL），如何换算成物质的量浓度（μM）？
A5：体外转录纯化好的RNA（仅一种RNA或同一长度的RNA混合物）测得质量浓度后可通过下列公式换算成物质的量浓度：
c=1000×ρ/[(nt×320.4)+18.02]
公式中：
c — 物质的量浓度，单位为（μM），1 μM=1 μmol/L=1 pmol/μL;
ρ — 质量浓度，单位为（ng/μL）;
nt — RNA链长度（核糖核苷酸数）；
320.4 — RNA链中单磷酸核糖核苷酸（NMP）的相对平均分子量（除去1分子水）；
18.02 — 1分子水的分子量。
参考文献
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