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22403 ToloSYBR One-Step RT-qPCR Kit (Universal)

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22403 ToloSYBR One-Step RT-qPCR Kit (Universal)

  • 规 格:
    • 250 rxns

货 号:

22403


价 格:

¥ 0

¥ 1650


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产品概述

产品描述

ToloSYBR One-Step RT-qPCR Kit (Universal) 是以RNA为模板进行RT-qPCR反应的试剂盒。在同一反应管中进行逆转录和定量PCR反应,操作简单并降低了污染的风险。本试剂盒使用了新一代逆转录酶ToloScript RTase和抗体法修饰的高效PureTaq热启动酶,配合优化的反应缓冲液对RNA模板进行精确定量。此外,本产品的缓冲液中含有特殊的ROX Passive Reference Dye,适用于所有型号的qPCR仪器,无需在不同的机型上调整ROX的浓度,只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。

 

 

产品组分

组分

22403-01 (250 rxns)

2 × ToloSYBR RT-qPCR buffer a

2 × 1.25 mL

ToloScript SYBR Enzyme mix b

2 × 125 μL

Nuclease-free water

3 × 1 mL

a. 组分中已包含dNTP Mixture、Mg2+、ROX Passive Reference Dye等。

b. ToloScript SYBR Enzyme mix中包含比例优化的 ToloScript RTase、RNase inhibitor及PureTaq DNA Polymerase等。

 

 

保存条件

-20℃避光保存,≤ 0℃避光运输;

 

 

实验流程

1.在qPCR管中配制如下反应体系

组分

体积

2 × ToloSYBR RT-qPCR buffer

10 μL

ToloScript SYBR Enzyme mix

1 μL

Primer F (10 μM)

0.4 μL

Primer R (10 μM)

0.4 μL

Template RNA

x μL

RNase-free ddH2O

Up to 20 μL

反应体系中各成分的量可根据以下原则自行调整:

  • —般来说反应体系中引物终浓度为0.2 μM即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时,可以在终浓度0.1~1.0 μM范围内调整引物浓度。
  • RT-qPCR灵敏度极高,建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大影响。因此推荐您将模板稀释后(如稀释至2 - 5 μL/样本)加入反应体系中,这样可以有效提高实验的重复性。
  • 建议使用total RNA模板总量为1 pg - 1 μg。

 

2.按下列反应程序进行qPCR反应

Stage

程序

温度

时间

循环

Stage 1

逆转录c

50℃

5 min

1 cycle

Stage 2

预变性d

95℃

30 sec

1 cycle

Stage 3

循环反应

95℃

10 sec

40 cycles

60℃

30 sec

Stage 4

熔解曲线

仪器默认程序

c.具有复杂二级结构或高GC区域的模板,可将逆转录温度提高到55℃或60℃,有助于提高扩增效率和灵敏度;逆转录时间可延长至15 min,有助于提高cDNA产量。

d.该预变性条件适合绝大多数扩增反应,如模板结构复杂,可将预变性时间延长至3 min提高预变性效果。

 

 

注意事项

1.模板稀释液选择:稀释模板可以使用购买的Nuclease-free water、DEPC水或者实验室自备的无核酸酶的水等。TE溶液中含EDTA,会抑制酶的活性,不可作为稀释液。

2.ToloScript SYBR Enzyme mix含有高浓度的甘油,使用前请短暂离心,收集至反应管底部,并用移液枪轻轻吸打,充分混匀后准确吸取。

3.引物设计时推荐目标PCR产物长度为80~150 bp。长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性,以排除其降解的可能。

4.当无模板阴性对照出现明显扩增时,应考虑反应体系污染及配制环境中气溶胶污染,可更换新的Kit、水、引物重复实验;反应体系在超净工作台内配制,减少气溶胶污染。

5.当熔解曲线出现多峰时,可考虑RNA模板带有基因组污染,非特异性扩增,引物二聚体等可能性。

6.如需提高扩增特异性,可适当提高退火温度(每次提高3℃)。

7.如需提高扩增效率,可将两步法标准程序的延伸时间延长至60 sec或使用三步法程序。两步法扩增程序一般将信号采集设置在60℃退火延伸阶段;三步法扩增程序应将信号采集设置在72℃延伸阶段。程序设置如下:

 

常见问题解答

Q1: 扩增曲线形状异常

A1:
1.1扩增曲线不光滑:信号太弱,经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。
1.2扩增曲线断裂或下滑:模板浓度较高,基线的终点值大于Ct值。减小基线终点(Ct值减4),重新分析数据。
1.3个别扩增曲线突然骤降:反应管内留有气泡。处理样本时要注意离心,进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

 

Q2: 反应结束无扩增曲线出现

A2:
2.1 反应循环数不够:一般设置循环数为40, 但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号,降低数据可信度。
2.2确认程序中是否设置了信号采集步骤:两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段;三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
2.3确认引物是否降解:长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性,以排除其降解的可能。
2.4模板浓度太低:减少稀释度重复实验,一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
2.5模板降解:重新制备模板,重复实验。

 

Q3:  Ct值出现太晚

A3:
3.1 扩增效率极低:优化反应条件,尝试三步法扩增程序,或者重新设计合成引物。
3.2 板浓度太低:减少稀释度重复实验,一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
3.3 模板降解:重新制备模板,重复实验。
3.4 PCR产物太长:推荐PCR产物长度为80-150 bp。
3.5 体系中存在PCR抑制剂:一般为模板带入,加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。

 

Q4:   阴性对照出现明显扩增

A4:
4.1 反应体系污染:更换新的Master Mix、水、引物重复实验。反应体系在超净工作台内配置,减少气溶胶污染。
4.2 引物二聚体的出现:配合熔解曲线进行分析。

 

Q5: 绝对定量时标准曲线线性关系不佳

A5:
5.1 加样误差:提高模板稀释倍数,提高加样体积。
5.2 标准品降解:重新制备标准品,重复实验。
5.3 模板浓度太高:提高模板稀释倍数。

 

Q6: 熔解曲线出现多峰

A6:
6.1 引物设计不优:根据设计原则设计合成新的引物。
6.2 引物浓度太高:适当降低引物浓度。
6.3 cDNA模板带有基因组污染:重新制备cDNA模板。

 

Q7: 实验重复性差

A7:
7.1 加样体积不准:使用性能较好移液器或将模板多倍稀释后再提高加入反应体系的模板体积。
7.2 定量PCR仪不同位置温度控制不一致:定期校准仪器。
7.3 模板浓度太低:模板浓度越低,重复性越差,减少模板稀释度或提高加样体积。

 

产品说明书

22403 ToloSYBR One-Step RT-qPCR Kit (Universal)

pdf

364.3KB

参考文献

COA查询

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