产品简介

ToloScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (with gDNA Eraser) 是含有基因组 DNA 去除步骤的 cDNA一链合成专用试剂盒，可使用 Total RNA 或 Poly A⁺ RNA 为模板合成第一链 cDNA，适合下游 qPCR 定量反应和长片段 cDNA 扩增。试剂盒中的 5 × gDNA Erase-Out Mix 可在 42℃，2 min 条件下快速去除基因组DNA 污染，保证实验数据真实可靠并可简化 qPCR 引物设计，无需跨外显子设计引物。 本产品提前预混了RTase、RNase inhibitor、dNTP Mix 等，使用时只需要根据下游实验添加适当的逆转录引物。

 

产品组成

组分	22115-01 (50 rxns)	22115-02 (100 rxns)
5 × gDNA Erase-Out Mix	100 μL	200 μL
4 × ToloScript RT EasyMix a	250 μL	500 μL
4 × NO RT Control EasyMix	25 μL	50 μL
Oligo (dT)20VN	50 μL	100 μL
Random hexamers	50 μL	100 μL
Nuclease-free water	1 mL	1 mL

a. 含RNase inhibitor、 dNTP Mix 等

 

保存条件

-20℃储存，≤ 0℃运输。

 

实验流程

体系后续反应为 PCR

1. RNA 模板变性

组分	体积
Total RNA	10 pg - 5 μg
or Poly A+ RNA	10 pg - 500 ng
Nuclease-free water	Up to 8 μL

65℃孵育 5 min，迅速置于冰上并静置 2 min。

● RNA 模板变性处理有助于二级结构解链，可明显提高一链cDNA 的产量。对于长度超过3 kb 的cDNA 片段，此步骤不可省略 。

● 完整RNA 是合成长片段cDNA 的前提， 如无法保证RNA 完整度，建议增大RNA 投入量以增加完整RNA 的拷贝数，RNA 投入量最多可增加至5 μg。

 

2. 基因组 DNA 去除

组分	体积
上一步混合液	8 μL
5 × gDNA Erase-Out Mix	2 μL

混匀，42℃反应 2 min

 

3. 一链 cDNA 合成反应体系

组分	体积
上一步混合液	10 μL
4 × ToloScript RT EasyMix	5 μL
Oligo (dT)20VN b	1 μL
Nuclease-free water	4 μL

b. 也可使用GSP (2 pmol) 或Random hexamers。

 

4. 一链 cDNA 合成反应程序

温度	时间
50℃	5 min c
85℃	2 min

c. 如需获得更多cDNA 产物，可将反应时间延长至30 min。

产物可立即用于后续实验，或置于-20℃保存；如需长期存放建议分装后-70℃保存。产物应避免反复冻融。

 

体系后续反应为 qPCR

1. 基因组 DNA 去除

组分	体积
5 × gDNA Erase-Out Mix	2 μL
Total RNA	10 pg - 1 μg
or Poly A+ RNA	10 pg - 100 ng
Nuclease-free water	up to 10 μL

混匀，42℃反应 2 min。

 

2. 一链 cDNA 合成反应体系

组分
上一步混合液	10 μL
4 × ToloScript RT EasyMix	5 μL
Oligo (dT)20VN	1 μL
Random hexamers	1 μL
Nuclease-free water	3 μL

● 也可使用GSP(2 pmol)进行逆转录。

 

3. 一链 cDNA 合成反应程序

温度
37℃	15 min d
85℃	2 min

d. 如果模板具有复杂二级结构或高GC 区域，可将反应温度升高至50℃。

产物可立即用于后续实验，或置于-20℃保存；如需长期存放建议分装后-70℃保存。产物应避免反复冻融。

 

No RT Control 反应（可选）

1. 反应体系

组分
基因组去除后的混合液e	10 μL
4 × NO RT Control EasyMix	5 μL
Nuclease-free water	5 μL

e. 若后续实验为PCR，该反应液特指PCR 实验 流程中第2 步结束后的产物；若后续实验为qPCR，该反应液特指qPCR 实验流程中第1 步结束后的产物 。

混匀后按照下列程序反转录。

 

2. 反应程序

温度	时间
37℃/50℃	15 min/5 min f
85℃	2 min

f. 根据应用场景选择对应的反转录温度和时间 。

产物可立即用于后续实验，或置于-20℃保存。

 

注意事项

1. 本产品仅作科研用途。

2. 为防止 RNase 污染，请保持实验区干净整洁，操作时需穿戴干净的手套、口罩，实验所用枪头、离心管等耗材均为 RNase-free。

3. 引物选择

 

后续实验为 PCR

a) 如果模板为真核生物来源，一般情况下首选 Oligo (dT)₂₀VN，与真核生物 mRNA 的 3' Poly A 尾配对，可获得全长 cDNA。

b) 基因特异性引物(GSP)的特异性最高。但有些情况下，用于 PCR 反应的 GSP 无法有效引导第一链cDNA 合成，这时可改用 Oligo (dT)₂₀VN。

c) Random hexamers 特异性最低，所有 RNA，包括 mRNA，rRNA，tRNA 均可以作为 Randomhexamers 的模板；当目标区域具有复杂二级结构或 GC 含量较高，或者模板为原核生物来源，使用 Oligo (dT)₂₀VN 或 GSP 无法有效引导 cDNA 合成时，可使用 Random hexamers 作为引物。

 

后续实验为 qPCR

a) 将 Oligo (dT)₂₀VN 与 Random hexamers 以说明书比例混合使用，可使 mRNA 的各个区域 cDNA 合成效率相同，有助于提高定量结果的真实性和重复性。

b) 可以不经过基因组去除步骤直接进行逆转录，空余体积用 Nuclease-free water 补足即可，产物可立即用于后续实验，或置于-20℃保存。