■ 产品简介

Rosetta 2(DE3) pLysS来源于Rosetta(DE3)，本菌株含有pLysSRARE2质粒，除了能够提供原Rosetta(DE3)宿主菌含有的AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA六个稀有密码子的tRNA外，还提供了第七个稀有密码子CGG的tRNA。同时，pLysSRARE2含有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶可以作用于大肠杆菌细胞壁上的肽聚糖溶解大肠杆菌，还可与T7 RNA聚合酶结合抑制其转录活性，进而降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达，适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。pLysSRARE2质粒具有氯霉素抗性。Rosetta2(DE3) pLysS载体通过提供稀有密码子，使得该宿主菌相对于其他大肠杆菌，能够提供更加“通用”的蛋白质表达，从而提升目的蛋白表达水平。DE3是溶源性的λDE3，所以带有T7 RNA聚合酶的染色体拷贝，因此适用于pET系列载体及其他T7启动子系列载体。经pUC19质粒转化检测，Rosetta2(DE3) pLysS感受态细胞的转化效率可达107 cfu/μg DNA以上。

■ 产品优势

● 高转化效率：>1×10⁷ cfu/µg pUC19 DNA
● 大大提高外源基因(特别是真核基因)在原核系统中的表达水平
● 降低目的基因的本底水平表达

■ 产品组成

基因型: F- ompT hsdS_B (r_B^- m_B^-) gal dcm (DE3) pLysSRARE2 (Cam^R)

■ 产品应用

Rosetta 2(DE3) pLysS感受态细胞适用于外源基因(特别是真核基因)在原核系统中的T7表达。

■ 存储条件

-80℃保存；请勿将本品置于-20℃或者液氮中保存!

■ 使用方法

1. 解冻感受态细胞：从-80 ℃取出感受态细胞，冰上融化约5-10 min，然后立即进行DNA样品的转化。

2. DNA样品的转化：每100 μL感受态可加入0.5-10 μL待转化DNA样品（例如质粒、连接产物或重组产物等），然后轻轻弹击管底约5-6次，立即冰上静置孵育30 min。

• 待转化DNA样品的加入体积不宜超过感受态细胞体积的1/10。

• 加入待转化DNA样品后应轻柔弹击混匀，避免使用移液枪剧烈吹打混匀。

• 用于质粒的转化时可将冰浴时间缩短至5-10 min；用于连接产物或重组产物转化时，建议冰浴时间为15-30 min以提高转化效率。

3. 热激处理：冰浴后，将装有感受态和DNA样品的的离心管快速置于42℃水浴中，静置热激90 s。随后立即转移至冰上静置2-3 min以快速冷却。

• 热激时间需要精确控制在45-90 s。

• 热激及转移至冰浴过程中禁止晃动离心管。

4. 复苏培养：加入900 μL 室温或37 ℃预热的LB培养基（或SOC培养基等），上下颠倒数次混匀，然后将离心管倾斜放置在恒温摇床中，37℃ 220 rpm复苏培养45 min。

• 37℃为常规复苏温度，若转入质粒对温度敏感或其它特殊情况需根据实验要求设置合适的温度。

5. 收菌涂板：用于质粒转化时，复苏后可直接取50-100 μL菌液涂板；用于连接产物或重组产物转化时，建议先5000 g，1 min室温离心，吸弃约900 μL上清，然后用剩余的约100 μL重悬菌液，涂布到含相应抗生素的LB平板上。

6. 过夜培养：将平板倒置放于37℃培养箱培养过夜。

• 培养前需要将平板在超净台中稍微晾至无明显水渍，有利于形成单克隆。

• 37℃为常规培养温度，若转入质粒对温度敏感或其它特殊情况需根据实验要求设置合适的温度。

■ 相关参数