■ 产品简介

TRIsol™ 试剂是一种即用型试剂，用于在一小时内从人、动物、植物、酵母或细菌的细胞和组织样本中分离高质量的总 RNA（同时也可分离 DNA 和蛋白质）。

TRIsol™ 试剂是由苯酚、异硫氰酸胍及其他专利成分组成的单相溶液，可有效分离各种分子量大小的 RNA。TRIsol™ 试剂能够高效抑制 RNase 活性，在样本匀浆过程中裂解细胞并溶解细胞成分，同时保持 RNA 的完整性。TRIsol™ 试剂支持同时处理大量样本，是对一步法 RNA 分离方法的改进。

使用 TRIsol™ 试剂可从同一份样本中依次沉淀 RNA、DNA 和蛋白质。用 TRIsol™ 试剂匀浆后加入氯仿，匀浆液会分为三层：透明的上层水相（含 RNA）、中间层和红色的下层有机相（含 DNA 和蛋白质）。用水相中的异丙醇沉淀 RNA，用中间层 / 有机相中的乙醇沉淀 DNA，用酚-乙醇上清液中的异丙醇沉淀蛋白质。沉淀得到的 RNA、DNA 或蛋白质经洗涤去除杂质后重悬，即可用于下游实验。

分离的 RNA 可用于 RT-PCR、Northern Blot、斑点杂交、poly (A)+ 富集、体外翻译、RNase 保护实验和分子克隆。分离的 DNA 可用于 PCR、限制性内切酶酶切和 Southern Blot。分离的蛋白质可用于 Western Blot、部分酶活回收和部分免疫沉淀实验。

 

■ 产品组成

组分	36220-01
TRIsol™  Reagent	100 mL

 

■ 保存条件

2–8℃避光保存，常温运输。

 

■ 适用范围

样本类型	每 1 mL TRIsol™ 试剂建议上样量
组织	10–40 mg
细胞	1×105–1×107 个细胞
细菌	1×107 个细胞
酵母	5–10×106 个细胞

重要提示：样本采集后请立即进行RNA分离；或液氮迅速冷冻样本，于-80°C或液氮中保存至分离。

 

■ 自备试剂

1 ) 氯仿。

2 ) 70%乙醇：使用无水乙醇新鲜配制。

 

■ 样本处理

1. 细胞和革兰氏阴性细菌样本

1.1 胰酶消化后的贴壁生长细胞：在指数生长期，取适量胰酶消化后的细胞加入1.5 mL离心管中，12,000×g离心1 min，弃上清，保留细胞沉淀。

1.2 各种拭子（宫颈刷）：将拭子（宫颈刷）在生理盐水中振荡20 sec。取1 mL振荡后的生理盐水加入至1.5 mL离心管中，12,000×g离心1 min，弃上清，保留细胞（细菌）沉淀。

1.3 液体培养细胞（革兰氏阴性细菌）：在1.5 mL离心管中加入适量处于指数生长期的培养细胞（革兰氏阴性细菌）的悬液（或者已计数的细胞悬液），12,000×g离心1 min，弃上清，保留细胞（细菌）沉淀。

1.4 细胞保存液保存的细胞 取出细胞保存液保存的细胞，37℃水浴中摇动至完全融化。取适量细胞转入1.5 mL离心管中，12,000×g 离心1 min。弃上清，保留细胞沉淀。

1.5 固体培养的革兰氏阴性细菌：用接种环刮取一定量的革兰氏阴性细菌，加入含1 mL生理盐水的1.5 mL离心管中充分混匀。12,000×g 离心1 min，弃上清，保留沉淀。

1.6 在上述沉淀（“细胞和革兰氏阴性细菌样本”中的“步骤1.1-1.5”）中加入1 mL TRIsol™，吹打混匀。室温（15-25℃）放置5 min。

1.7 贴壁生长细胞

1.7.1 在指数生长期，弃去6孔培养板（T-25培养瓶或35 mm培养皿）中培养液，保留贴壁生长的细胞。加入1 mL TRIsol™，轻轻晃动培养板（瓶/皿），使底部被TRIsol™完全经过。轻轻吹打，确保全部细胞被裂解。

1.7.2 转移至一个新的1.5 mL离心管中。室温（15-25℃）放置5 min。

 

2. 革兰氏阳性细菌和真菌（酵母）标本

2.1 收集约107 个革兰氏阳性或真菌（酵母）细胞，12,000×g 离心1 min，弃上清。用50 μL生理盐水悬浮细胞，转移至预冷的研钵中，加液氮磨成粉末。

2.2 将细胞粉末转移至1.5 mL离心管中，将液氮充分挥发。

2.3 加入1 mL TRIsol™，吹打混匀。室温（25℃）放置5 min。

 

3. 动物组织的处理

按下表使用组织量

组织	使用量
高丰度RNA的组织（如肝、肾、胃）	≤ 10 mg
中丰度RNA的组织（如脑、肺、卵巢、胸腺、脾、心脏肌肉等）	≤ 15 mg
低丰度RNA的组织（膀胱、骨、脂肪）	≤ 20 mg

3.1液氮研磨法

3.1.1 取≤ 20 mg组织，转移至预冷的研钵中，加液氮充分磨成粉末。

3.1.2 将组织粉末转移至1.5 mL离心管中，将液氮充分挥发。

3.1.3 加入1 mL TRIsol™，吹打混匀。

3.1.4 室温（15-25℃）放置5 min。

3.1.5 将离心管放入离心机，5000 rpm离心10 sec，尽量吸取上清转入至1.5 mL离心管中。

3.2 高速匀浆法

3.2.1 用镊子取出组织，转入1.5 mL离心管中。

3.2.2 加入1 mL 75%乙醇漂洗1 次，取出组织块用吸水纸将乙醇吸干。尽量剪碎组织，称取≤ 20 mg的组织，转入2mL平底离心管。

3.2.3 在2 mL平底离心管中加入1 mL TRIsol™，立即使用匀浆器充分匀浆。

3.2.4 室温（15-25℃）放置5 min。尽量吸取上清转入至1.5 mL离心管中。

*注意：匀浆过程中如产生泡沫，5000 rpm离心10 sec可以消除泡沫和组织残渣。

 

4. 植物组织的处理

组织	使用量
植物种子、嫩芽和嫩叶	10-20 mg
植物纤维组织	20-30 mg

4.1 液氮研磨法

4.1.1 取≤ 30 mg细碎的植物组织，转移至预冷的研钵中，加液氮磨成粉末。

4.1.2 将组织粉末转移至1.5 mL离心管中，将液氮充分挥发。

4.1.3 加入1 mL TRIsol™，吹打混匀。

4.1.4 室温（15-25℃）放置5 min。尽量吸取上清转入至1.5 mL离心管中。

4.2 高速匀浆法

4.2.1 在2 mL平底离心管中加入≤ 30 mg搅碎（应尽量切碎）的组织和1 mL TRIsol™，使用匀浆器充分匀浆。

4.2.2 室温（15-25℃）放置5 min。尽量吸取上清转入至1.5 mL 离心管中。

*注意：匀浆过程中如产生泡沫，5000 rpm离心10 sec可以消除泡沫和组织残渣。

 

■ 提取步骤

1. 在含上述处理样本的1.5 mL离心管中，以每1mL核酸提取缓冲液加入0.2 mL的氯仿，闭盖，剧烈震荡15 sec。

2. 室温（15-25℃）放置3 min。

3. 12,000×g，4℃离心15 min。

4. 转移上清液至新的2mL离心管中，加入1.5 倍上清体积的无水乙醇，吹打混匀。

*注意：吸取上清过程中避免吸入白色中间层。

5. 4℃ 12,000×g 离心10 min，弃上清，保留管底的RNA沉淀。

6. 加入1mL 70%乙醇，充分悬浮沉淀。

7. 12,000×g离心1 min，尽量弃上清，保留沉淀。

*注意：弃上清时务必小心，保证沉淀不丢失。

8. 50℃，开盖干燥5 min。干燥过程中再次吸弃残留液体。

*注意：RNA样品不能过于干燥，否则很难溶解。

用适量DEPC水或TE（pH=8.5）溶解RNA样本，-80℃保存备用。

 

■ RNA产量测定

1. 吸光度法：用RNase-free water稀释样本，测定260 nm 和 280 nm 吸光度。浓度计算公式：A260 × 稀释倍数 × 40 = μg RNA/mL。计算 A260/A280比值，比值约 2.0 视为纯度合格。可使用 NanoDrop分光光度计直接定量 RNA，无需预先稀释。

2. 荧光法：使用 Qubit™ RNA 定量试剂盒特异性检测完整RNA，不受样本中蛋白质或其他污染物影响。

 

■ 注意事项

1. 匀浆后，加氯仿前，样品可在-70℃放置一个月。

2. RNA沉淀可以保存在75%乙醇中，2-8℃一周或-20℃一年。

3. 本产品配制和操作过程中涉及苯酚和氯仿等OSHA规定的危险物品，操作时必须做好必要的防护措施，戴口罩手套，并且在通风的生物安全柜中进行。

4. 按当地法律法规处理生物样本和废弃物。