■ 产品简介

ToloPrep Plasmid DNA Mini Preparation Kit柱式质粒DNA小量抽提试剂盒采用了一种新型的吸附材料，该吸附柱拥有良好的流速、超强的DNA结合能力和优秀的洗脱效率。改良的配方使试剂盒的菌液裂解能力、DNA与吸附柱的结合能力大大加强，对于高拷贝质粒，从1-5 mL过夜菌液(OD600 = 2.0)中可以获20-50 μg的质粒DNA。同时，由本试剂盒抽提得到的质粒纯度高，OD260/OD280比值一般为 1.8-2.0 之间，可直接用于转化、DNA测序、PCR、基于PCR的突变、体外转录等。

此外，本试剂盒配方经过特殊优化，无需加入RNaseA，操作过程快速、方便，整个抽提过程可以在20 min内完成。

■ 产品组分

■ 保存方法及注意事项

本试剂盒于常温（10-30°C）运输保存。

第一次使用前，请按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入相应体积的无水乙醇，并做好标记。

使用前如发现Buffer P2和Buffer N3有沉淀，可在37°C水浴几分钟，即可恢复澄清。请勿剧烈晃动Buffer P2。使用后应立即盖紧盖子。

Buffer P2和Buffer N3中含有刺激性的化合物，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。

本产品仅供科研使用。

■ 快速操作流程

1. 准备工作

a. 检查Buffer PW是否已加入无水乙醇。

b. 80%乙醇配制：使用ddH2O或DEPC水配制，现配现用。

c. 检查Buffer P2和Buffer N3是否有沉淀产生。

2. 取1-5 mL过夜（12-16 h）培养的菌液，12,000 × g 离心1 min收集菌体，弃去全部培养基。

· 处于生长平台期的菌体用于质粒抽提得率最高，过度培养可能导致DNA降解。

· 对于高拷贝质粒，从5 mL过夜菌液中通常可以获得超过20 μg质粒DNA，不推荐使用更大的菌液量。过量的菌体会导致后续裂解不充分，反而影响提取质粒的质量。

· 对于低拷贝或>10 kb质粒，如果使用更多的菌液，则同一个样品分多管收集，每管不超过5 mL，分别裂解，合并同一个样品的各管裂解液通过同一个吸附柱来获得更高的得率。

3. 在沉淀中加入250 μL Buffer P1，彻底悬浮菌体。

· 一定要彻底悬浮菌体，肉眼无可见菌块，否则影响得率和质量。

4. 加入250 μL Buffer P2，立即温和颠倒离心管6-8次混匀，室温静置 3 min。

· 裂解时间最长不能超过5 min。

· 如果同时操作多个样品，每加入一管就立即混匀一管。

· 此时菌液应变得清亮粘稠，如果不清亮，可能菌体过多，应减少菌体量或按相同比例同时增加Buffer P1和Buffer P2。

5. 加入300 μL Buffer N3，立即温和颠倒离心管6-8次混匀。12,000 × g 离心10 min。

· 如果同时操作多个样品，建议每加入一管就立即混匀一管。

· 加入Buffer N3后，离心管中会立即出现大量白色絮状沉淀。

· 如离心后上清中有小的絮状物，可12,000 × g 再次离心3 min。

6. 将步骤5中上清液移入吸附柱。12,000 × g离心30 sec，倒掉收集管中液体。

· 吸附柱最大有效容积为750 μL，如果裂解液过多，可以重复该步骤直至所有裂解液流过吸附柱。

7. 加入600 μL Buffer PW，12,000 × g 离心30 sec，倒掉收集管中液体。

8. 加入600 μL 80%乙醇水溶液，12,000 × g离心3 min，将吸附住转移到一个新的1.5 mL离心管中，丢弃装有废液的收集管。

· 取出吸附柱时需注意吸附柱底部不能碰到收集管中废液，如果不小心碰到，需要倒掉收集管中废液，将吸附柱再次放回收集管中，空柱12,000 × g离心1 min，再小心取出吸附柱，转移到新的1.5 mL离心管。

9. 在吸附膜中央加20-100 μL Buffer EB，室温静置1 min后，12,000 × g离心1 min，保存管中DNA溶液。

· Buffer EB可以根据下游实验需求，更换为TE或DEPC水。

· 将Buffer EB预热至60°C可以进一步提高得率。

· 将离心后的Buffer EB重新加入吸附柱进行二次洗脱可以明显提高得率。