产品描述

T4 DNA Ligase 可催化 dsDNA 平末端或粘性末端相邻核苷酸的 5’磷酸末端和 3’羟基末端形成磷酸二酯键，还可催化 RNA 和双链中的 ssDNA 或 RNA 链连接，但不能催化全单链核苷酸连接。连接产物可直接转化多种化学感受态细胞。适用于标记 RNA 3’末端，环化 RNA 和 DNA 寡聚核苷酸，克隆长片段 cDNA等核酸操作。

 

 

产品组分

组分	32210-01	32210-02
T4 DNA Ligase (400 U/µL)	100 μL	1 mL
10 × T4 DNA Ligase buffer	1 mL	2 × 1 mL

 

 

保存条件

-20℃储存；≤ 0℃运输。

 

 

活性定义

在 20 μL 的连接反应体系中，6 μg 的λDNA-Hind Ⅲ分解物在 16℃下反应 30 min 时，催化 50%以上的 DNA 片段发生连接所需要的酶量定义为 1 个活性单位(U)。

 

 

 

质量控制

✽ 核酸外切酶残留检测：将 2000 U 连接酶和 0.6 μg λ-Hind III 在 37℃下反应 1 h，DNA 的电泳谱带不发生变化。

✽ 核酸内切酶残留检测：将 2000 U 连接酶和 0.6 μg 超螺旋 pUC18 DNA 在 37℃下反应 1 h，DNA 电泳谱带不发生变化。

 

 

实验流程

DNA 片段与载体连接：

1.反应体系

组分	体积
10 × T4 DNA Ligase buffer	2 μL
线性化载体	0.03 pmol
插入 DNA 片段	0.3 pmol
T4 DNA Ligase (400 U/µL)	1 μL
ddH2O	Up to 20 μL

· 建议插入 DNA 片段与载体的摩尔比应为 3:1～10:1；

· 单酶切、同尾酶酶切载体以及平末端载体与酶切处理获得的插入片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，防止其自身环化；

· 混匀、短暂离心后反应；

· 进行实验操作时应将酶放置于冰上，待实验结束后于-20℃保存。

 

2.反应条件

a.16℃连接过夜或 23℃反应 1 h。

b.当进行平滑末端或 TA 连接时，可适当延长反应时间以提高连接效率。 

 

3. 转化

 

2）取上述连接产物（不超过 10 μL）加入 100 μL 感受态细胞中，轻轻混匀，冰上静置 30 min。

3）42℃水浴热激 90 sec 后，立即置于冰上冷却 2～5 min。

4）加入 900 μL SOC 或 LB 液体培养基 (不添加抗生素)，150 rpm、37℃摇菌复壮 45 min。

5）将复壮后的菌液用 5000 rpm 离心 5 min，弃掉 900 μL 上清，并用剩余培养液将菌体重悬，用无菌涂布棒将菌液均匀涂布在含有正确抗性的平板上，室温正置 10 min。待菌液被平板吸收后，37℃倒置培养过夜。

· 如果使用超级感受态细胞(转化效率>10 8 cfu/μg)，可无需离心直接吸取 50 - 100 μL 孵育后的菌液涂板。

6）平板上长出的克隆可以使用“菌落 PCR”进行快速鉴定。针对阳性克隆，可根据实验需求进行序列测定

 

 

 

注意事项

✽ 产品第一次使用时，先短暂离心，避免酶量损失。

✽ T4 DNA Ligase不稳定，使用时冰上操作，用完立即放回-20℃。

✽ 本产品仅作科研用途。