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32134 LbuCas13a (C2c2) Nuclease

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32134 LbuCas13a (C2c2) Nuclease

  • 规 格:
    • 100 pmoL
    • 1,000 pmoL

货 号:

32134


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产品概述

产品描述

LbuCas13a 核酸酶(又名 C2c2)是依赖于 crRNA 介导的 RNA 内切核酸酶,来源于 Leptotrichia buccalis菌株。在靶标单链 RNA 存在 PFS 序列的情况下,可特异地识别并剪切靶标 RNA。此外,Cas13a 也具有反式剪切活性(即旁路剪切活性/附属剪切活性),即当 LbuCas13a 蛋白与 crRNA、靶标 RNA 结合形成三元复合物后,便会被激活针对非特异序列单链 RNA 的反式剪切活性,将体系中的任意序列单链 RNA 切碎。该活性也被用于靶标核酸的快速检测试剂盒的开发。例如,Broad 研究所的张锋团队便利用 Cas13a 蛋白开发了名为“SHERLOCK”的下一代分子诊断系统(详细信息请参考 PMID: 28408723) 。

 

 

产品组分

组分

32134-01 (100 pmol)

32134-03 (1,000 pmol)

 LbuCas13a Nuclease (10 μM) a

100 pmol

1,000 pmol

 10 × HOLMES Buffer for Cas13a

1 mL

1 mL

a.LbuCas13a Nuclease浓度为10 μM,即10 pmol/μL,100 pmol规格的总体积为10 μL,1,000 pmol规格的总体积为100 μL;
 

 

保存条件

组分-20℃储存;≤ 0℃运输。

 

 

活性定义

在总体积为 20 μL 的 1 × HOLMES Buffer for Cas13a [pH 7.6]反应体系中,37℃反应条件下,1 min内剪切 1 pmol ssRNA 探针所需的 Cas13a 酶量定义为 1 transU。

 

 

实验流程

1.反式剪切实验

组分

体积 

终浓度 

10 × HOLMES Buffer for Cas13a

2 μL 1 ×

10 μM LbuCas13a Nuclease

0.05~0.5 μL 25~250 nM

10 μM crRNA

0.05~0.5 μL 25~250 nM

10 μM Target RNA

0.05~0.5 μL 25~250 nM

10 µM ssRNA Reporter (FAM-BHQ1)

0.05~0.5 μL 25~250 nM

Nuclease-free Water

Up to 20 μL  

· 反式剪切体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整,用量较少时可先将各组分稀释后加入体系,LbuCas13a Nuclease 可用 1 × HOLMES Buffer for Cas13a 稀释,稀释后需立即使用(若要稀释后的 Cas13 酶长期保存,请使用 Cas13 Dilution Buffer,#32013),crRNA、Target RNA 及 ssRNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀释,但极低浓度的Target RNA(例如 LOD 实验)建议用 0.1% Tween 20 稀释并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。

· 实时荧光定量 PCR 仪检测荧光信号,37℃反应,每 30 sec 采集一次荧光信号。

 

 

实验结果

Fig 1. Results of Cas13 collarteral cleavage at different concentrations of target RNA.

 

 

注意事项

1. Cas13a 的顺式剪切(cis-cleavage): Cas13a 在 crRNA 的引导下,特异性地剪切 target RNA,且对 target RNA的 PFS 序列要求并不严格。

2. Cas13a 的反式剪切(trans-cleavage): 当 target RNA 存在时,Cas13a/crRNA 与 target RNA 形成三元复合物(Cas13a/crRNA/target RNA),同时,Cas13a 被激发反式剪切活性,将反应体系中任意序列的单链 RNA切碎。

3. 为防止 RNase 污染,请保持实验区干净整洁,操作时需穿戴干净的手套、口罩,实验所用枪头、离心管等耗材均为 RNase-free。

4. Cas13a 蛋白对热敏感,容易失活,应全程冰上配置反应体系,并在使用后立即将酶置于-20℃保存。

5. 本公司提供的 Cas13a 蛋白及反应缓冲液不含除 Cas13a 外的任何其它核酸酶活性。

6. 本产品仅供科研使用。

常见问题解答

Q1: 如何设计LbuCas13a的sgRNA?

A1: LbuCas13a的crRNA可参照以下序列设计:5’–GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3’ ,(黑色代表direct repeat区,蓝色下划线表示crRNA与特异靶标序列互补配对的spacer区,建议spacer区长度为22-28 nt)。

 

产品说明书

#32134 LbuCas13a Nuclease

pdf

1010.4KB

参考文献

COA查询

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