32116 AacCas12b (C2c1) Nuclease
产品概述
■ 产品简介
AacCas12b(又名C2c1)核酸酶是依赖于RNA介导的内切核酸酶，在靶标DNA存在PAM(TTN)的情况下，可特异地剪切靶标双链DNA，使DNA双链断裂并生成粘性末端。而AacCas12b特异地剪切单链DNA靶标不依赖PAM序列。当AacCas12b酶与sgRNA、靶标DNA结合形成三元复合物后，能启动针对非特异序列ssDNA的剪切，将体系中的任意序列ssDNA切碎。
AacCas12b来源于嗜酸耐热菌Alicyclobacillus acidoterrestris，最佳剪切反应温度为48℃。AacCas12b依赖于crRNA和tracrRNA(或连接后形成的sgRNA)引导。此外，AacCas12b不仅可以应用于靶标dsDNA的剪切，还可用于靶标核酸的快速检测，详见本公司开发的HOLMESv2[1]核酸快检技术。
■ 产品组成
| 组分 | 32116-01 (100 pmol) | 32116-03 (1,000 pmol) |
 AacCas12b Nuclease (10 μM) a |
100 pmol | 1000 pmol |
 10 × HOLMES Buffer for Cas12b |
1 mL | 1 mL |
a. AacCas12b Nuclease浓度为10 μM，即10 pmol/μL，100 pmol规格的总体积为10 μL，1,000 pmol规格的总体积为100 μL；
■ 保存条件
-20℃储存。
■ 活性定义
在总体积为20 μL的1 × HOLMES Buffer for Cas12b [pH 8.5]反应体系中，48℃反应条件下，1 min内剪切1 pmol ssDNA探针所需的Cas12b酶量定义为1 transU。
■ 实验流程
1. 顺式剪切反应体系
| 组分 | 体积 | 终浓度 |
| 10 × HOLMES Buffer for Cas12b | 2 μL | 1 × |
| 10 μM AacCas12b Nuclease | 0.5 μL | 250 nM |
| 10 μM sgRNA | 0.5 μL | 250 nM |
| 1 μM Target DNA b | 0.5 μL | 25 nM |
| Nuclease-free water | Up to 20 μL |
b. 体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。
● 若用核酸电泳来分析剪切产物，建议使用dsDNA靶标，因为ssDNA靶标会被Cas12b进一步切碎。对于20 μL反应体系，推荐target DNA的使用量为100 ng～500 ng，且target DNA片段长度在300 bp～3 kb范围内。不同长度target DNA需要的Cas酶和sgRNA的量根据target DNA的摩尔量计算，建议保持Cas酶:sgRNA:target DNA的摩尔比为10:10:1，以尽量确保target DNA被剪切完全。
48℃反应30 min~1 h，85℃灭活5 min，核酸电泳分析剪切产物。
2. 反式剪切反应体系
| 组分 | 体积 | 终浓度 |
| 10 × HOLMES Buffer for Cas12b | 2 μL | 1 × |
| 10 μM AacCas12b Nuclease | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
| 10 μM sgRNA | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
| 1 μM Target DNA c | 0.5~5 μL | 25~250 nM |
| 10 μM ssDNA Reporter | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
| Nuclease-free water | Up to 20 μL |
c. 体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。
● 体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整，用量较少时可先将各组分稀释后加入体系，AacCas12b Nuclease可用1×HOLMES Buffer for Cas12b稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的Cas12酶长期保存，请使用Cas12 Dilution Buffer，#32012），sgRNA、Target DNA及ssDNA Reporter可用Nuclease-free Water稀释，但极低浓度的Target DNA（例如LOD实验）建议用0.1% Tween 20稀释并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。
实时荧光定量PCR仪记录荧光信号，48℃反应，每30 sec采集一次荧光信号。
■ 实验结果
顺式剪切实验
反式剪切实验
■ 参考文献
[1] Li L, Li S, Wu N, et al. HOLMESv2: A CRISPR-Cas12b-Assisted Platform for Nucleic Acid Detection and DNA Methylation Quantitation[J]. ACS Synthetic Biology. 2019, 8(10): 2228-2237.
常见问题解答
Q1: 常见的Cas12b酶有哪些？它们和Cas12a家族有什么区别？
A1: Cas12b家族通常都比Cas12a家族更加耐热，常见的AacCas12b可在37°C～55°C温度范围内工作，最适温度为48°C；而AapCas12b相对AacCasb更加耐热，可在37°C～65°C温度范围内发挥剪切功能。因此，AapCas12b更适合与LAMP (60°C～65°C)联用。
Q2: 如何设计AacCas12b的sgRNA？
A2: AacCas12b的crRNA包含20 nt的引导序列(spacer区)和一个14 nt的重复序列；tracrRNA序列包含一个16 nt反重复区和三个茎环，全长约91 nt；保留crRNA的重复区和tracrRNA反重复区进行改造的融合体sgRNA长度约为110 nt，可保持与crRNA:tracrRNA共同介导相似的效率，AacCas12b的sgRNA可参照以下序列设计：
5′– GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGUGG
CAAAGCCCGUUGAGCUUCUCAAAUCUGAGAAGUGGCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3′,（下划线表示与特异靶标序列互补配对的spacer区)。
Q3: 顺式剪切体系中Cas12b酶:sgRNA:target DNA的比例应如何调节？
A3: 为了使靶标dsDNA被剪切完全，常规建议Cas12b酶:sgRNA:target DNA=10:10:1。当sgRNA利用效率不高时，建议尝试Cas12b酶:sgRNA=1:1.25～2，太过量的sgRNA也不利于Cas12b的剪切。同时，sgRNA如果是转录制备的，需要注意转录产物的纯度。
Q3: AacCas12b对双链DNA靶标的剪切位点在哪里？取决于什么？
A3: Cas12b家族都识别富含T的PAM序列(5′-TTN-3′), 且对双链DNA靶标的剪切位点取决于PAM序列。以AacCas12b为例，其剪切位点在非靶标链(NTS)距PAM第17位附近，和靶标链(TS)距PAM第24位附近，交错剪切，并产生7 nt的5′悬垂。
Q4: dsDNA靶标和ssDNA靶标均能激活AacCas12b的反式剪切活性吗？哪种效率更高？
A4: dsDNA靶标和ssDNA靶标均能激活AacCas12b的反式剪切活性，这点与Cas12a相同。但不同的是，ssDNA靶标激发Cas12b反式活性的效率高于dsDNA靶标；而dsDNA靶标激发Cas12a反式活性的效率高于ssDNA靶标。
Q5: AacCas12b的反式剪切有序列偏好性吗？
A5: 有文献报道Cas12b剪切PolyA，PolyT，PolyC的效率高于PolyG，说明Cas12b蛋白对ssDNA底物的反式剪切效率也是受到ssDNA序列影响的，具体的偏好性需要实验验证。
参考文献
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