32112 BoCas12a(Cpf1) Nuclease
产品概述
■ 产品简介
BoCas12a (又名Cpf1)核酸酶来源于Bacteroidetes oral taxon 274 (HOT 274)，是由crRNA介导的DNA核酸内切酶，在靶标双链DNA存在PAM (TTN，以及一些非经典PAM) 序列的情况下，特异地剪切靶标双链DNA，使DNA双链断裂并生成粘性末端。而BoCas12a特异地剪切单链DNA靶标不依赖PAM序列。当BoCas12a酶与crRNA、靶标DNA结合形成三元复合物后，能启动针对非特异序列ssDNA的剪切，将体系中的任意序列ssDNA切碎。因此，BoCas12a酶不仅可用于DNA靶标的特异剪切，也可用于靶标核酸的快速检测，详见本公司开发的HOLMES[1]核酸快检技术。
■ 产品组成
| 组分 | 32112-01 (100 pmol) | 32112-03 (1,000 pmol) |
 BoCas12a Nuclease (10 μM) a |
100 pmol | 1000 pmol |
 10 × HOLMES Buffer for Cas12a |
1 mL | 1 mL |
a. BoCas12a Nuclease浓度为10 μM，即10 pmol/μL，100 pmol规格的总体积为10 μL，1,000 pmol规格的总体积为100 μL；
■ 保存条件
-20℃储存。
■ 活性定义
在总体积为20 μL的1 × HOLMES Buffer for Cas12a [pH 8.5]反应体系中，37℃反应条件下，1 min内剪切1 pmol ssDNA探针所需的Cas12a酶量定义为1 transU[2]。
■ 实验流程
1. 顺式剪切反应体系
| 组分 | 体积 | 终浓度 |
| 10 × HOLMES Buffer for Cas12a | 2 μL | 1 × |
| 10 μM BoCas12a Nuclease | 0.5 μL | 250 nM |
| 10 μM crRNA | 0.5 μL | 250 nM |
| 1 μM Target DNA b | 0.5 μL | 25 nM |
| Nuclease-free water | Up to 20 μL |
b. 体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。
● 用核酸电泳来分析剪切产物，建议使用dsDNA靶标，因为ssDNA靶标会被Cas12a进一步切碎。对于20 μL反应体系，推荐target DNA的使用量为100 ng～500 ng，且target DNA片段长度在300 bp～3 kb范围内。不同长度target DNA需要的Cas酶和crRNA的量根据target DNA的摩尔量计算，建议保持Cas酶:crRNA:target DNA的摩尔比为10:10:1，以尽量确保target DNA被剪切完全。
37℃反应30 min~1 h，85℃灭活5 min，核酸电泳分析剪切产物。
2. 反式剪切反应体系
| 组分 | 体积 | 终浓度 |
| 10 × HOLMES Buffer for Cas12a | 2 μL | 1 × |
| 10 μM BoCas12a Nuclease | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
| 10 μM crRNA | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
| 1 μM Target DNA c | 0.5~5 μL | 25~250 nM |
| 10 μM ssDNA Reporter | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
| Nuclease-free water | Up to 20 μL |
c. 体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。
● 体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整，用量较少时可先将各组分稀释后加入体系，BoCas12a Nuclease可用1×HOLMES Buffer for Cas12a稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的Cas12酶长期保存，请使用Cas12 Dilution Buffer，#32012），crRNA、Target DNA及ssDNA Reporter可用Nuclease-free Water稀释，但极低浓度的Target DNA（例如LOD实验）建议用0.1% Tween 20稀释并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。
实时荧光定量PCR仪记录荧光信号，37℃反应，每30 sec采集一次荧光信号。
■ 实验结果
顺式剪切实验
反式剪切实验
■ 参考文献
[1] Li S, Cheng Q, Wang J, et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection[J]. Cell Discovery. 2018, 4: 20.
[2] Lv H, Wang J, Zhang J, et al. Definition of CRISPR Cas12a Trans-Cleavage Units to Facilitate CRISPR Diagnostics[J]. Frontiers in Microbiology. 2021, 12: 766464.
常见问题解答
参考文献
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