32110 Lb5Cas12a (Cpf1) Nuclease-规格,图片,属性-上海吐露港生物科技有限公司

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32110 Lb5Cas12a (Cpf1) Nuclease

规格：
- 100 pmol
- 1,000 pmol

货号：

32110

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产品概述

■ 产品简介

Lb5Cas12a (又名Cpf1)核酸酶来源于Lachnospiracea bacterium MA2020菌株。Lb5Cas12a是由crRNA介导的DNA核酸内切酶，在靶标双链DNA存在PAM (TTN) 序列的情况下，特异地剪切靶标双链DNA，使DNA双链断裂并生成粘性末端。而Lb5Cas12a特异地剪切单链DNA靶标不依赖PAM序列。当Lb5Cas12a酶与crRNA、靶标DNA结合形成三元复合物后，能启动针对非特异序列ssDNA的剪切，将体系中的任意序列ssDNA切碎。因此，Lb5Cas12a酶不仅可用于DNA靶标的特异剪切，也可用于靶标核酸的快速检测，详见本公司开发的HOLMES^[1]核酸快检技术。

■ 产品组成

组分	32110-01	32110-03
Lb5Cas12a Nuclease (10 μM) ^a	100 pmol	1000 pmol
10 × HOLMES Buffer for Cas12a	1 mL	1 mL

a. Lb5Cas12a Nuclease浓度为10 μM，即10 pmol/μL，100 pmol规格的总体积为10 μL，1,000 pmol规格的总体积为100 μL；

■ 保存条件

-20℃储存。

■ 活性定义

在总体积为20 μL的1 × HOLMES Buffer for Cas12a [pH 8.5]反应体系中，37℃反应条件下，1 min内剪切1 pmol ssDNA探针所需的Cas12a酶量定义为1 transU^[2]。

■ 实验流程

1. 顺式剪切反应体系

组分	体积	终浓度
10 × HOLMES Buffer for Cas12a	2 μL	1 ×
10 μM Lb5Cas12a Nuclease	0.5 μL	250 nM
10 μM crRNA	0.5 μL	250 nM
1 μM Target DNA ^b	0.5 μL	25 nM
Nuclease-free water	Up to 20 μL

b. 体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。

● 若用核酸电泳来分析剪切产物，建议使用dsDNA靶标，因为ssDNA靶标会被Cas12a进一步切碎。对于20 μL反应体系，推荐target DNA的使用量为100 ng～500 ng，且target DNA片段长度在300 bp～3 kb范围内。不同长度target DNA需要的Cas酶和crRNA的量根据target DNA的摩尔量计算，建议保持Cas酶:crRNA:target DNA的摩尔比为10:10:1，以尽量确保target DNA被剪切完全。

37℃反应30 min~1 h，85℃灭活5 min，核酸电泳分析剪切产物。

2. 反式剪切反应体系

组分	体积	终浓度
10 × HOLMES Buffer for Cas12a	2 μL	1 ×
10 μM Lb5Cas12a Nuclease	0.05~0.5 μL	25~250 nM
10 μM crRNA	0.05~0.5 μL	25~250 nM
1 μM Target DNA ^c	0.5~5 μL	25~250 nM
10 μM ssDNA Reporter	0.05~0.5 μL	25~250 nM
Nuclease-free water	Up to 20 μL	25~250 nM

c. 体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。

● 体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整，用量较少时可先将各组分稀释后加入体系，Lb5Cas12a Nuclease可用1×HOLMES Buffer for Cas12a稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的Cas12酶长期保存，请使用Cas12 Dilution Buffer，#32012），crRNA、Target DNA及ssDNA Reporter可用Nuclease-free Water稀释，但极低浓度的Target DNA（例如LOD实验）建议用0.1% Tween 20稀释并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。

实时荧光定量PCR仪记录荧光信号，37℃反应，每30 sec采集一次荧光信号。

■ 实验结果

顺式剪切实验

反式剪切实验

■ 参考文献

[1] Li S, Cheng Q, Wang J, et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection[J]. Cell Discovery. 2018, 4: 20.
[2] Lv H, Wang J, Zhang J, et al. Definition of CRISPR Cas12a Trans-Cleavage Units to Facilitate CRISPR Diagnostics[J]. Frontiers in Microbiology. 2021, 12: 766464.

常见问题解答

Q1: Cas12a与Cas9有什么区别？

A1: 总的来说，Cas9需要crRNA和tracrRNA共同引导(或融合后的sgRNA单独引导)，特异性识别并剪切带PAM（5´-NGG-3´）的dsDNA靶标，不具有反式剪切活性；而Cas12a只需要crRNA单独引导，特异性识别并剪切带PAM（5´TTTN-3´ or 5´TTN-3´）的dsDNA靶标，对ssDNA靶标的识别和剪切不依赖PAM序列，且dsDNA靶标和ssDNA靶标均能激活Cas12a的反式剪切活性，可非特异性剪切体系中的ssDNA。详细对比如下表：

	Cas9	Cas12a (Cpf1)
Classification	Class II Type II	Class II Type V
Nuclease Domains	RuvC and HNH	RuvC only
Guide RNA	crRNA and tracrRNA	crRNA only
PAM Sequence	5´-NGG-3´	5´TTTN-3´ or 5´TTN-3´
Cis-Cleavage Target	dsDNA with PAM	dsDNA with PAM or ssDNA
Cis-Cleavage Site	3 bases 5´ of the PAM	~18 bases 3´ of the PAM
Termini of Cis-Cleavage Products	Blunt ends	5´ overhang
Trans-Cleavage Target	/	ssDNA

Q2: Lb5Cas12a的crRNA应该如何设计？

A2: Lb5Cas12a的crRNA包含全长20 nt的直接重复序列(DR区，又名scaffold区)，以及长度为20 nt的引导序列(spacer区)。Lb5Cas12a的crRNA可参照以下序列设计：
5′– AAUUUCUACUAUUGUAGAUNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3′,（下划线表示与特异靶标序列互补配对的spacer区)。

Q3: 不同来源的Cas12a对PAM区识别有差异吗？

A3: Cas12a家族都识别富含T的PAM序列，其中FnCas12a、MbCas12a等识别5’-TTN-3’；AsCas12a、LbCas12a、Lb2Cas12a等识别5’-TTTN-3’。

Q4: 常见的Cas12a酶还有哪些？它们的crRNA的直接重复序列（又名DR区或Scaffold区）序列有什么不同？

A4: 常见的Cas12a酶包括FnCas12a、LbCas12a、AsCas12a等，Cas12a家族crRNA的直接重复序列都高度保守，详见下表（下表中crRNA的5’端第一位碱基会被Cas12a处理掉，因此设计crRNA时可忽略）：

Q5: 顺式剪切体系中Cas12a酶:crRNA:target DNA的比例应如何调节？

A5: 为了使靶标dsDNA被剪切完全，常规建议Cas12a酶:crRNA:target DNA=10:10:1。当crRNA利用效率不高时，建议尝试Cas12a酶:crRNA=1:1.25～2。

Q6: dsDNA靶标和ssDNA靶标均能激活Cas12a的反式剪切活性吗？哪种效率更高？

A6: 双链DNA靶标和单链DNA靶标均能激活Cas12a的反式剪切活性(trans-cleavage，又名collateral cleavage)，这点与Cas12b相同。但不同的是，ssDNA靶标激发Cas12b反式活性的效率高于dsDNA靶标；而dsDNA靶标激发Cas12a反式活性的效率高于ssDNA靶标。

Q7: Cas12a对dsDNA靶标和ssDNA靶标的剪切位点取决于什么，具体在哪里？

A7: Cas12a对靶标双链DNA的剪切位点主要取决于PAM，原有研究显示，Cas12a在非靶标链(NTS)距PAM第18位和靶标链(TS)距PAM第23位进行剪切，从而形成5'端5-nt悬垂的粘性末端。但实际上，该剪切位点并不是非常专一，受到不同来源Cas12a、不同靶标序列以及不同长度crRNA的影响。具体来说，非靶标链距PAM 的第14位附近(12^th-15^th)和第18位附近(18^th-20^th)均有剪切，靶标链距PAM的第22位附近(21^st-24^th)发生剪切。Cas12a家族对靶标单链DNA的剪切不依赖PAM序列，剪切位点距第一个与 crRNA引导序列配对的3'-碱基的第22位附近(21^st-23^th)。

Q8：CRISPR荧光检测实验操作注意事项有哪些？

A8：在靶标浓度较高的情况下，Cas蛋白的反式剪切速度会非常快，可在数分钟（甚至数十秒）内到达平台荧光值。因此，建议提前打开仪器并设好反应程序（在程序设置阶段需要注意CRISPR反应与qPCR不同，需要关闭荧光校正或基线扣除等选项）。CRISPR反应体系建议在冰上配置反应体系，并将靶标加在管盖上，盖上盖子并确保程序无误后短暂离心，使不同孔之间同时开始反应，并迅速放入仪器中开始记录荧光。同时，注意设置不加靶标的阴性对照，避免无法识别出已经到达平台的荧光信号。

Q9：CRISPR荧光检测实验结果如何判读？

A9：CRISPR荧光检测体系的阴性对照一般是无靶标对照，即反应体系中除了Target以外的其他组分都加。在荧光信号数据分析时，建议关注3个重要指标：1）信噪比S/N，即阳性对照体系与阴性对照体系在相同反应时间点的荧光值比值，高S/N值说明检测体系能清晰区分目标与非目标反应，灵敏度与可靠性更高；2）荧光增量（Δ荧光值），即同一反应孔的终点荧光值减去起始荧光值的差；3）荧光信号上升阶段的斜率，斜率越大代表反应体系的效率越高，即探针被剪切的速度越快。此外，不同qPCR仪器之间荧光度值差异非常，需尽量在同一机器上进行数据对比。