■ 产品描述

High-yield Cas13a crRNA Synthesis and Purification Kit是基于T7 RNA聚合酶的体外RNA转录试剂盒，可高效进行Cas13a crRNA的制备。使用本试剂盒时，仅需按照本试剂盒说明书设计并合成Target Antisense Oligo，每次反应可获得50-150 μg的Cas13a crRNA。

 

■ 产品组分

Part A：体外转录试剂（-20℃保存）	31905-01 (25 T)	31905-02 (50 T)
5 × TranscriptMax Reaction Buffer	100 μL	200 μL
NTP mix	200 μL	400 μL
TranscriptMax Enzyme Mix	55 μL	110 μL
Nuclease-free Water	1 mL	1 mL
2 × PCR Master Mix	250 μL	500 μL
Cas13a Sense Oligo	25 μL	25 μL
Cas13a Control Target Antisense Oligo a	25 μL	25 μL
2 × DNase Ⅰ Buffer	625 μL	1250 μL
DNase Ⅰ	100 μL	200 μL

Part B：纯化磁珠（4℃保存）	3620F-01 (25 T)	3620F-01 (25 T)
Magnetic Beads b	625 μL	1250 μL

a. Cas13a Control Target Antisense Oligo 是阳性对照，可与 Cas13a Sense Oligo 退火延伸后，作为转录模板使用，用来测试体外转录体系的反应效率。在 37°C孵育 30 min 条件下，对照转录反应体系生成的 crRNA 产量≥50 μg，其产量在纯化后由 NanoDrop 测定。在变性条件下进行 TBE-Urea gel 电泳，可观察到 crRNA 单条带大小约为 65 nt。

b. 本产品中 Part B 组分（纯化磁珠，#3620F）与 Part A 组分保存条件不同，因此 Part B 组分需单独运输！

 

■ 保存条件

Part A组分-20℃储存；Part B组分2～8℃储存（磁珠严禁冷冻！）。

 

■ 需自备的实验物品

• PCR仪

• 无水乙醇

• 异丙醇

• 无核酸酶水

• 96 孔磁力架（推荐TOLOBIO 96孔磁力架，货号：#49002）

• 96 孔板或 PCR 8 联排管

• 移液器及吸头

 

■ Cas13a crRNA 转录引物设计

1.Cas13a crRNA 转录原理示意图

Cas13a crRNA 转录原理示意图如图 1 所示，试剂盒中已提供 Cas13a Sense Oligo，只需根据待测目标序列设计 Target Antisense Oligo。

 

 

图1. Cas13a crRNA转录原理示意图

 

2.Target Antisense Oligo 设计举例

2.1 选取 28 nt 的 Target Sequence，下划线部分为 Target Sequence。

 

2.2 根据选取的 Target Sequence 设计 Target Antisense Oligo，则其序列应为：

其中波浪线部分为Cas13a DR 部分反向互补序列，为固定序列。下划线部分为 Target Sequence。

 

2.3 转录得到的 Cas13a crRNA 序列应为：

波浪线部分为 LwaCas13a crRNA DR 序列，下划线部分为 Target Sequence 反向互补序列。

 

■ 实验流程

1.DNA 转录模板制备

Cas13a Sense Oligo与Target Antisense Oligo退火延伸反应完成后便可作为转录模板使用。

1.1 退火延伸体系配制

组分	体积
2 × PCR Master Mix	10 μL
Cas13a Sense Oligo (10μM)	0.5 μL
Target Antisense Oligo (10μM)	0.5 μL
Nuclease-free Water	9 μL

1.2 PCR 退火延伸程序设置

温度	时间	循环数
95℃	2 min	× 1
95℃	15 s	× 5
55℃	15 s
72℃	10 s
25℃	Hold on

 

2. Cas13a crRNA体外转录

2.1 按下表试剂的顺序进行反应体系的配制。

组分	体积
5 × TranscriptMax Reaction Buffer	4 μL
NTP mix	8 μL
TranscriptMax Enzyme Mix	2.1 μL
Nuclease-free Water	0.9 μL
DNA 转录模板	5 μL

• 请将试剂解冻并完全混匀后再使用。

• 5 × TranscriptMax Reaction Buffer 中含有亚精胺，而亚精胺与核酸容易形成复合体沉淀，DNA 转录模板尽量最后加入到体系中。

• 上述反应体系的总体积为 20 μL，可适当等比例调整反应体系。

2.2 将上述试剂充分混匀，然后短暂离心，在37℃下孵育2-4 h进行体外转录即可获得crRNA产物。延长转录时间（如过夜转录12-16 h）可提高crRNA产量。

2.3 37℃孵育结束后，按照下表配制30 μL的DNase 反应液加入到20 μL的体外转录产物中，以去除转录体系中的DNA模板。

组分	体积
2 × DNase Ⅰ Buffer	25 μL
DNase Ⅰ	4 μL
Nuclease-free Water	1 μL

DNase Ⅰ反应条件：37℃，30 min。

 

3.Cas13a crRNA 转录产物磁珠纯化

3.1 首先将磁珠从 4℃冰箱中取出，在室温中放置约 30 min，使其温度平衡至室温。颠倒或涡旋振荡使磁珠充分混匀，吸取 25 μL 磁珠和 50 μL 异丙醇加入到 50 μL 待纯化的 crRNA 样品中，用移液器吹打充分混匀。

3.2 室温孵育 5 min，使 RNA 结合到磁珠上。

3.3 将样品置于磁力架上 5 min，待溶液澄清后，小心移除上清。

3.4 保持样品置于磁力架上，加入 200 μL 新鲜配制的 80%乙醇，漂洗磁珠，室温孵育 30 s，小心移除上清。

注：漂洗时使用的 80% (v/v)乙醇需要使用 Nuclease-free water 新鲜配制，配制方法举例如下：分别量取8 mL 无水乙醇和 2 mL Nuclease-free water，混匀后可得 10 mL 80% (v/v)乙醇。

3.5 重复步骤 4，共漂洗 2 次。

3.6 保持样品始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠 5 min。

注：磁珠开盖晾干时要避免过分干燥，如果磁珠出现龟裂，则提示磁珠过分干燥，此时 RNA 的洗脱效率会降低。

3.7 将样品从磁力架上取出，加入 50 μL Nuclease-free water，用移液器吹打以充分混匀，室温静置 5 min。

3.8 将样品置于磁力架 5 min，待溶液澄清后，小心转移上清至一个新的 Nuclease-free PCR 管中，即得到纯化后的 Cas13a crRNA。

3.9 将纯化后的crRNA于70℃处理10 min，以灭活残留的DNase I。