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24604 One Step Yeast Direct PCR Kit
产品概述
产品描述
本试剂盒可直接快速地对酵母菌落进行 PCR扩增，酵母菌落经裂解液简单处理后即可作为PCR模板使用。无需进行基因组提取等步骤，极大地缩短了实验耗时，操作简单快速。试剂盒中配有2 × Yeast Direct PCR Mix (with Dye)，包含特殊修饰的热启动DNA Polymerase、dNTP以及优化的缓冲体系。PCR反应时只需加入引物和模板即可进行扩增。体系中预混有电泳缓冲液和染料，可在反应结束后直接进行电泳，使用方便快捷。经反复测试广泛适用于10 kb以内目标片段扩增。
产品优势
✽ 快速便捷：对酵母菌落或菌液直接进行裂解，裂解产物用于PCR扩增，无需提取基因组。
✽ 操作方便： PCR反应只需加入引物和模板即可进行扩增，反应结束后直接进行电泳。
✽ 扩增能力强：广泛适用于10 kb以内目标片段扩增。
实验案例
1.优异的扩增性能
酵母菌落为模板，扩增不同长度的DNA片段，PCR结束后电泳显示，2×Yeast Direct PCP Mix(with dye)可以高效特异地扩增长达8 kb的DNA片段。
实验流程
1.DNA提取
1.1吸取20~50 μL的1 × Yeast Lysis Buffer到1.5 mL离心管中，用无菌枪头或牙签蘸取适量的酵母菌落到离心管中，并搅拌混匀。
1.2 放置于95℃反应5~10 min。
1.3 取1~5 μL直接进行PCR反应。
2.PCR扩增体系配制
2×Yeast Direct PCR Mix (with Dye)完全解冻后上下颠倒混匀，于冰上配制如下反应体系：
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组分 |
体积 |
|
2 × Yeast Direct PCR Mix (with Dye) |
25 μL |
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Primer F (10 μM) |
2 μL |
|
Primer R (10 μM) |
2 μL |
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裂解产物 |
1~5 μL |
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ddH2O |
Up to 50 μL |
◆ 各组分使用前应充分混匀；
◆ PCR扩增体系中引物终浓度为0.2~0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可在0.1~0.5 μM范围内调整引物终浓度；
◆ 裂解产物加入量不应超过PCR反应总体积的1/10;
◆ 配制好PCR反应体系，置于涡旋仪上涡旋混匀，然后瞬时离心将反应液集于管底。
3.PCR反应程序设定
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Stage |
程序 |
温度 |
时间 |
循环 |
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Stage 1 |
预变性 |
95℃ |
5 min |
1 cycle |
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Stage 2 |
循环反应 a |
95℃ |
15 sec |
35 cycles |
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55~72℃ |
15 sec |
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72℃ |
30 sec/kb |
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Stage 3 |
彻底延伸 |
72℃ |
5 min |
1 cycle |
a.退火温度需要根据引物Tm值进行调整，一般设置为低于引物Tm值2~5℃即可。
4.PCR产物电泳
PCR扩增反应结束后直接取3~5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。本产品中已经预混有电泳缓冲液和染料，因此扩增产物无需再添加DNA Loading Buffer。
产品组分
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组分 |
24604 (100 rxns) |
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○ 1 × Yeast Lysis Buffer |
20 mL |
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● 2 × Yeast Direct PCR Mix (with Dye) b |
2 × 1.25 mL |
b.组分中已包含 dNTP、Mg2+、DNA Polymerase、Dye等。
保存条件
2×Yeast Direct PCR Mix (with Dye) 需-20℃避光保存；其余组分2~8℃保存；≤ 0℃运输。
常见问题解答
Q1: 无扩增产物或扩增产量低
A1:
（1）模板加入量不合适：裂解产物加入量不应超过PCR反应总体积的1/10，将裂解产物稀释10倍后再进行PCR扩增，或增大PCR反应体系；可尝试减少或增加裂解的酵母菌落/菌液浓度。
（2）PCR反应体系或程序出错：重新配制实验，确保PCR反应体系配制无误；确保反应程序设置无误。
（3）PCR程序不合适：增加PCR循环数以获得更多的扩增产物；降低PCR循环反应中的退火温度（每次降低3℃）。
（4）PCR引物错配严重：重新设计引物，并设置已纯化过的酵母基因组为模板的阳性对照。
（5）DNA释放效率差：延长95℃裂解时间至30min。
（6）DNA裂解混合液保存不当或保存时间过久，基因组DNA降解：裂解混合液可在4℃保存2-3天，或-20℃存放3个月。
（7）PCR试剂盒保存不当失去活性：2×Yeast Direct PCR Mix (with Dye) 应保存于-20℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，短时间可在4℃存放。
Q2：95℃反应后裂解混合液变浑浊，且颜色偏白，该现象是否正常。
A2： 这是正常现象，不影响后续PCR扩增。
Q3：非特异性扩增
A3：
（1）引物浓度过高：降低引物浓度。
（2）PCR引物错配：重新设计引物，引物3’端最后一个碱基选择C或G；最后8个碱基应避免出现连续错配；引物3’端尽量避免出现发夹结构；引物Tm值控制在60℃-72℃之间，GC含量控制在40%-60%之间，且正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。
（3）PCR扩增反应退火温度设置太低：提高退火温度（每次提高2℃）。
（4）PCR循环数过多：减少PCR循环数。
（5）PCR反应体系在室温下配制：冰上配制反应体系可显著降低非特异性扩增。
Q4：阴性对照出现目的条带
A4：
（1）PCR体系出现污染：逐个更换PCR反应体系中的每一个组分。
（2）操作工具污染：实验所有试剂或器材均应高压灭菌。
（4）PCR循环数过多：减少PCR循环数。
（5）PCR反应体系在室温下配制：冰上配制反应体系可显著降低非特异性扩增。
参考文献
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