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24602 One Step Plant Direct PCR Kit

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24602 One Step Plant Direct PCR Kit

  • 规 格:
    • 100 rxns

货 号:

24602


价 格:

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产品概述

产品描述

本试剂盒可对不同类型的植物叶片、种子简单裂解后进行PCR扩增,无需进行基因组提取等步骤。试剂盒中包含的1 × Plant Lysis Buffe可用于新鲜或冻存植物样品的裂解,所得裂解产物可无需纯化可直接作为PCR扩增模板,而且裂解液中加入的特殊保护剂可使裂解样本多次冻融后仍可有效扩增。扩增使用的2 × Plant Direct PCR Mix (with Dye),包含特殊修饰的热启动DNA Polymerase、dNTP以及优化的缓冲体系,对植物中的PCR抑制物有极强的耐受性,同时保持了卓越的扩增性能,广泛适用于5 kb以内DNA片段的扩增。体系中预混有电泳缓冲液和染料,可在反应结束后直接进行电泳。

 

产品优势

高性能DNA聚合酶:定向改造的DNA聚合酶,对PCR抑制物有超强耐受性。
宽广的样本兼容性:适合各种常见的植物叶片及种子的扩增。
操作方便:PCR反应只需加入引物和模板即可进行扩增,反应结束后直接进行电泳。
扩增能力强:广泛适用于5 kb以内目标片段扩增。

 

实验案例

以加热裂解法所获得的拟南芥叶片粗提液、水稻叶片粗提液、烟草叶片粗提液以及玉米种子粗提液为模板,同时以上述四种植物基因组DNA为对照,使用2×Plant Direct PCR Mix (with Dye)分别扩增0.5 kb、1.5 kb、5 kb、0.5 kb、0.8 kb、1 kb、1.3 kb、0.8 kb、0.5 kb、1.2 kb、0.5 kb等11个不同目的片段,均可成功扩增。说明2×Plant Direct PCR Mix (with Dye)有宽广的样本兼容性和较强的扩增能力。

 

实验流程

1. 植物样本处理 
1.1 植物叶片样品处理 
直接法:推荐使用幼嫩叶片,使用打孔器或者刀,取直径 0.5~3 mm 的叶片直接加入到 50 μL PCR 扩增反应体系中。长片段和复杂样本的扩增,推荐使用直径<1 mm 的叶片作为模板。 
加热裂解法:推荐使用幼嫩叶片,取直径 1~5 mm 的叶片置于 50 μL 的 1 × Plant Lysis Buffer 中,95℃加热5~10min,较难裂解的叶片可适当延长加热时间至 20 min,加热裂解后溶液呈绿色,瞬时离心,取上清液置于 4℃备用,取 1~2 μL 上清液用于 PCR 扩增。 
研磨破碎法:推荐使用幼嫩叶片,取直径 1~5 mm 的叶片置于 50 μL 的 1 × Plant Lysis Buffer 中,用枪头挤压捣碎叶片,叶片破碎后溶液呈绿色,瞬时离心,取上清液置于 4℃备用,取 1~2 μL 上清液用于 PCR扩增。 
1.2 植物种子样本处理
加热裂解法:用解剖刀切取直径约 5 mm的种子,加入到 100 μL 的 1 × Plant Lysis Buffer 中,95℃加热 5~ 10 min,较难裂解的样本可适当延长加热时间至 30 min,加热结束后瞬时离心,取上清液置于 4℃备用,取 1~2 μL 用于 PCR 扩增。 
研磨破碎法:用解剖刀切取直径约 5 mm的种子,加入到 100 μL 的 1 × Plant Lysis Buffer 中,用枪头或者钢珠研磨样本。瞬时离心,取上清液置于 4℃备用,取 1~2 μL 用于 PCR 扩增。
2. PCR 扩增 
2.1 PCR 扩增体系配制
2×Plant Direct PCR Mix (with Dye)完全解冻后上下颠倒混匀,于冰上配制如下反应体系

组分

体积

2 × Plant Direct PCR Mix (with Dye)

25 μL

Primer F (10 μM)

2 μL

Primer R (10 μM)

2 μL

裂解产物

1~5 μL

ddH2O

Up to 50 μL

◆ 各组分使用前应充分混匀。
◆ PCR扩增体系中引物终浓度为0.2~0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时,可在0.1~0.5 μM范围内调整引物终浓度。
◆ 裂解产物加入量不应超过PCR反应总体积的1/10;
◆ 配制好PCR反应体系,置于涡旋仪上涡旋混匀,然后瞬时离心将反应液集于管底。

2.2.PCR反应程序设定

Stage 1

预变性

95℃

5 min 

1 cycle

 

Stage 2

 

 

循环反应 a

 

95℃

15 sec

35 cycles

 

 

55~72℃

15 sec

72℃

30 sec/kb

Stage 3

彻底延伸

72℃

5 min                                                  

1 cycle

a.退火温度需要根据引物Tm值进行调整,一般设置为低于引物Tm值2~5℃即可。

2.3.PCR产物电泳
PCR扩增反应结束后直接取3~5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。本产品中已经预混有电泳缓冲液和染料,因此扩增产物无需再添加DNA Loading Buffer。

 

产品组分

组分

24602 (100 rxns)

○ 1 × Plant Lysis Buffer

20 mL

2 × Plant Direct PCR Mix (with Dye) b

2 × 1.25 mL

b.组分中已包含 dNTP、Mg2+、DNA Polymerase、Dye等。

 

保存条件

2 × Plant Direct PCR Mix (with Dye) 需-20℃避光保存;其余组分2~8℃保存;≤ 0℃运输。

 

常见问题解答

Q1: 无扩增产物或扩增产量低

A1: 
(1)模板加入量不合适:裂解产物加入量不应超过PCR反应总体积的1/10,将裂解产物稀释10倍后在进行PCR扩增,或增大PCR反应体系;可尝试减少或增加裂解的酵母菌落/菌液浓度。
(2)PCR反应体系或程序出错:重新配制体系,确保PCR反应体系配置无误;确保反应程序设置无误。
(3)PCR程序不合适:增加PCR循环数以获得更多的扩增产物;降低PCR循环反应中的退火温度(每次降低3℃)。
(4)PCR引物错配严重:重新设计引物,并设置以纯化过的酵母基因组为模板的阳性对照。
(5)DNA释放效率差:延长95℃裂解时间至30min。
(6)DNA裂解混合液保存不当或保存时间过久,基因组DNA降解:裂解混合液可在4℃保存2-3天,或-20℃存放3个月。
(7)PCR试剂盒保存不当失去活性:2×Plant Direct PCR Mix (with Dye) 应保存于-20℃,使用时避免反复冻融。若使用频繁,短时间可在4℃存放。

 

Q2:非特异性扩增

A2:
(1)引物浓度过高:降低引物浓度。
(2)PCR引物错配:重新设计引物,引物3’端最后一个碱基选择C或G;最后8个碱基应避免出现连续错配;引物3’端尽量避免出现发夹结构;引物Tm值控制在60℃-72℃之间,GC含量控制在40%-60%之间,且正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。
(3)PCR扩增反应退火温度设置太低:提高退火温度(每次提高2℃)。
(4)PCR循环数过多:减少PCR循环数。
(5)PCR反应体系在室温下配制:冰上配制反应体系可显著降低非特异性扩增。

 

Q3:阴性对照出现目的条带

A3:
(1)PCR体系出现污染:逐个更换PCR反应体系中的每一个组分。
(2)操作工具污染:实验所有试剂或器材均应高温高压灭菌。     

 

 

产品说明书

#24602 One Step Plant Direct PCR Kit Manual.pdf

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898.0KB

参考文献

COA查询

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