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24601 One Step Mouse Genotyping Kit
产品概述
产品描述
本试剂盒配备了整套的DNA粗提取及PCR扩增体系，可直接快速地对小鼠组织(如鼠尾、鼠耳、鼠趾、肌肉等)样本进行 PCR扩增，无需匀浆、破碎、过夜消化、酚氯仿抽提、DNA沉淀或柱式纯化等操作，极大缩短了实验耗时，操作简单快速。试剂盒中配有2 × Mouse Direct PCR Mix (with Dye)，包含特殊修饰的热启动DNA Polymerase、dNTP以及优化的缓冲体系。PCR反应时只需加入引物和模板即可进行扩增，减少了开盖、移液等操作，显著降低样品交叉污染的风险，并且提高了检测通量和结果的可重复性。体系中预混有电泳缓冲液和染料，可在反应结束后直接进行电泳，使用方便快捷。经反复测试，本试剂盒广泛适用于10 kb以内目标片段扩增，并适用于4对引物以内的多重PCR反应，可用于基因型快速鉴定(Rapid Genotyping)、小鼠基因分型等。
产品优势
✽ 快速便捷：可对小鼠组织(鼠尾、鼠耳、鼠趾、肌肉等样本)进行裂解，裂解产物直接用于PCR扩增，无需提取基因组。
✽ 操作方便：PCR反应只需加入引物和模板即可进行扩增，反应结束后直接进行电泳。
✽ 扩增能力强：广泛适用于10 kb以内目标片段扩增，并适用于4对引物以内的多重PCR反应。
实验案例
以鼠尾、鼠耳、腿肉、鼠趾为样本裂解获得的裂解液为模板，扩增不同长度的DNA片段，PCR结束后电泳显示，本试剂盒可高效特异的扩增1-8 kb的DNA片段。
实验流程
1.DNA提取
1.1 推荐使用组织量
1~3 mm小鼠尾尖 ；
2~5 mm2小鼠耳朵；
1~2个小鼠脚趾。
1.2 配制新鲜的1 × 小鼠组织裂解液
根据需要裂解的样品数量，配制适量1 × 裂解液，单个样品所需裂解液配制方法如下：
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1 ×裂解液(单样品)组分 |
体积 |
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1 × Mouse Tissue Lysis Buffer |
200 μL |
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Proteinase K |
4 μL |
1.3 小鼠组织裂解
将样品和新鲜配制的1×裂解液置于55℃水浴中孵育30 min（对于10 kb以内的目标片段，30 min孵育已足以释放足量的DNA模板）。为保证DNA充分释放，请务必将组织全部浸没至裂解液中。孵育结束后组织块可能并未完全消化，属正常情况，不影响使用。
1.4 小鼠组织裂解产物预处理
孵育结束后，将样品置于95℃或沸水浴中加热5 min灭活Proteinase K。然后将样品12,000 rpm (13,400 g) 离心5 min，可以立即取上清进行PCR反应；或将上清转移至另一个灭菌EP管中，-20℃存放至少三个月。
2.PCR扩增体系配制
2×Mouse Direct PCR Mix (with Dye)完全解冻后上下颠倒混匀，于冰上配制如下反应体系：
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组分 |
体积 |
|
2 × Mouse Direct PCR Mix (with Dye) |
25 μL |
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Primer F (10 μM) |
2 μL |
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Primer R (10 μM) |
2 μL |
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裂解产物 |
2~5 μL |
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ddH2O |
Up to 50 μL |
◆ 各组分使用前应充分混匀。
◆ PCR扩增体系中引物终浓度为0.2~0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可在0.1~0.5 μM范围内调整引物终浓度。
◆ 裂解产物加入量不应超过PCR反应总体积的1/10;
◆ 配制好PCR反应体系，置于涡旋仪上涡旋混匀，然后瞬时离心将反应液集于管底。
3.PCR反应程序设定
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Stage |
程序 |
温度 |
时间 |
循环 |
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Stage 1 |
预变性 |
95℃ |
5 min |
1 cycle |
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Stage 2
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循环反应 a |
95℃ |
15 sec |
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55~72℃ |
15 sec |
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72℃ |
30 sec/kb |
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Stage 3 |
彻底延伸 |
72℃ |
5 min |
1 cycle |
35 cyclesa.退火温度需要根据引物Tm值进行调整，一般设置为低于引物Tm值2~5℃即可。
4.PCR产物电泳
PCR扩增反应结束后直接取3~5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。本产品中已经预混有电泳缓冲液和染料，因此扩增产物无需再添加DNA Loading Buffer。
产品组分
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组分 |
24601 (100 rxns) |
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○ 1 × Mouse Tissue Lysis Buffer |
20 mL |
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● Proteinase K |
400 μL |
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● 2 × Mouse Direct PCR Mix (with Dye) b |
2 × 1.25 mL |
b.组分中已包含 dNTP、Mg2+、DNA Polymerase、Dye等。
保存条件
2 × Mouse Direct PCR Mix (with Dye) 需-20℃避光保存；其余组分2~8℃保存；≤ 0℃运输。
常见问题解答
Q1: 24601试剂盒中的Proteinase K的储存条件？
A1：Proteinase K储存条件为4℃，若长期不使用（三个月以上）建议-20℃保存。
Q2: 24601试剂盒能否做其他物种？
Q2：确定可以做大鼠和小鼠。其他昆虫、哺乳动物也可以，但不能保证实验结果。
Q3：使用24601，裂解孵育后小鼠组织形态没变，是否裂解成功？
A3：鼠尾、鼠趾、鼠耳等组织裂解后形态没变属于正常现象，裂解液加热孵育后已经有大部分基因组DNA释放出来。
Q4：95℃加热后裂解液变浑浊，且颜色偏白，该现象是否正常？
A4： 这是正常现象，不影响后续PCR扩增。
Q5: 24601裂解组织后的裂解液可以用NanoDrop测DNA浓度吗?
A5：不可以，因为裂解组织获得的裂解液成分比较复杂，包括buffer、Proteinase k，且基因组DNA的浓度低，NanoDrop测量的浓度偏高。
Q6：使用24601做多重PCR，扩增效果差，如何优化？
A6：引物之间会互相干扰，建议单独扩增，若单独扩增条带特异，建议调整引物间使用比例，适当调整退火温度，同时，适当延长退火时间（30 sec-1 min)。如果需重新设计引物时，在保证引物特异性的前提下，使引物之间的Tm值尽量接近，差值不要太大（2-3℃）。
Q7:使用24601裂解小鼠组织效果不好时，有何建议？
A7:
（1）建议增大组织的裂解量，并延长孵育时间；
（2）建议优化PCR反应体系、反应程序。
Q8：扩增产量低或者无法扩增
A8：
（1）PCR反应中加入的裂解液过量或裂解液中混入了PCR抑制物：减少裂解液用量；或将裂解产物稀释10倍后再进行PCR扩增；或增大PCR反应体系；
（2）模板加入量不适合：裂解产物用量不应超过PCR反应总体积的1/10；
（3）DNA释放效率较差：可尝试延长55℃孵育时间置3h;
（4）Proteinase K没有充分灭活：延长95℃灭活时间或在沸水浴中进行灭活;
（5）PCR循环数不够：增加PCR循环数以获得更好的扩增效果；
（6）循环反应退火温度设置太高：降低退火温度(每次降低3℃)；
（7）PCR引物错配：重新设计引物，并添加已纯化过的小鼠基因组为模板的阳性对照；
（8）样本裂解混合液保存不当或保存时间过久，DNA 基因组已经降解：裂解混合液可在4℃保存2~3天，或-20℃存放3个月；
（9）PCR 试剂保存不当失去活性：试剂盒应保存于-20℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，可在4℃短时间存放。
Q9：非特异性扩增
A9：
(1)引物浓度过高：降低引物浓度。
(2)PCR引物错配：重新设计引物；引物3’端最后一个碱基选择C或G；最后8个碱基应避免出现连续错配；引物3’端尽量避免出现发夹结构；引物Tm值控制在60℃-72℃之间，GC含量控制在40%-60%之间，且正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。
(3)PCR扩增反应退火温度设置太低：提高退火温度（每次提高2℃）；
(4)PCR循环数过多：减少循环数。
(5)PCR反应体系在室温下配置：冰上配置反应体系可显著降低非特异性扩增。
Q10: 阴性对照出现扩增
A10:
（1）PCR反应体系出现污染：逐个更换PCR反应体系中的每一个组分；
（2）操作工具污染：实验所有试剂或器材均应高压灭菌。
参考文献
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