3
ph
%{tishi_zhanwei}%

24601 One Step Mouse Genotyping Kit

  • 24601.png

24601 One Step Mouse Genotyping Kit

  • 规 格:
    • 100 rxns

货 号:

24601


价 格:

¥ 0

¥ 1000


联系经销商

*具体价格咨询当地经销商

隐藏域元素占位

产品概述

产品描述

本试剂盒配备了整套的DNA粗提取及PCR扩增体系,可直接快速地对小鼠组织(如鼠尾、鼠耳、鼠趾、肌肉等)样本进行 PCR扩增,无需匀浆、破碎、过夜消化、酚氯仿抽提、DNA沉淀或柱式纯化等操作,极大缩短了实验耗时,操作简单快速。试剂盒中配有2 × Mouse Direct PCR Mix (with Dye),包含特殊修饰的热启动DNA Polymerase、dNTP以及优化的缓冲体系。PCR反应时只需加入引物和模板即可进行扩增,减少了开盖、移液等操作,显著降低样品交叉污染的风险,并且提高了检测通量和结果的可重复性。体系中预混有电泳缓冲液和染料,可在反应结束后直接进行电泳,使用方便快捷。经反复测试,本试剂盒广泛适用于10 kb以内目标片段扩增,并适用于4对引物以内的多重PCR反应,可用于基因型快速鉴定(Rapid Genotyping)、小鼠基因分型等。

 

 

产品组分

组分

24601 (100 rxns) 

○ 1 × Mouse Tissue Lysis Buffer

20 mL

Proteinase K

400 μL

2 × Mouse Direct PCR Mix (with Dye) a

2 × 1.25 mL

a.组分中已包含 dNTP、Mg2+、DNA Polymerase、Dye等。

 

 

保存条件

2 × Mouse Direct PCR Mix (with Dye) 需-20℃避光保存;其余组分2~8℃保存;≤ 0℃运输。

 

 

产品优势

快速便捷:可对小鼠组织(鼠尾、鼠耳、鼠趾、肌肉等样本)进行裂解,裂解产物直接用于PCR扩增,无需提取基因组。

操作方便:PCR反应只需加入引物和模板即可进行扩增,反应结束后直接进行电泳。

扩增能力强:广泛适用于10 kb以内目标片段扩增,并适用于4对引物以内的多重PCR反应。

 

 

实验案例

以鼠尾、鼠耳、腿肉、鼠趾为样本裂解获得的裂解液为模板,扩增不同长度的DNA片段,PCR结束后电泳显示,本试剂盒可高效特异的扩增1-8 kb的DNA片段。

 

 

实验流程

1.DNA提取

1.1 推荐使用组织量

1~3 mm小鼠尾尖 ;

2~5 mm2小鼠耳朵;

1~2个小鼠脚趾。

 

1.2 配制新鲜的1 × 小鼠组织裂解液

根据需要裂解的样品数量,配制适量1 × 裂解液,单个样品所需裂解液配制方法如下:

1 ×裂解液(单样品)组分

体积 

1 × Mouse Tissue Lysis Buffer

200 μL

Proteinase K

4 μL

1.3 小鼠组织裂解

将样品和新鲜配制的1×裂解液置于55℃水浴中孵育30 min(对于10 kb以内的目标片段,30 min孵育已足以释放足量的DNA模板)。为保证DNA充分释放,请务必将组织全部浸没至裂解液中。孵育结束后组织块可能并未完全消化,属正常情况,不影响使用。

1.4 小鼠组织裂解产物预处理

孵育结束后,将样品置于95℃或沸水浴中加热5 min灭活Proteinase K。然后将样品12,000 rpm (13,400 × g) 离心5 min,可以立即取上清进行PCR反应;或将上清转移至另一个灭菌EP管中,-20℃存放至少三个月。

 

2.PCR扩增体系配制

2×Mouse Direct PCR Mix (with Dye)完全解冻后上下颠倒混匀,于冰上配制如下反应体系:

 

组分

体积 

2 × Mouse Direct PCR Mix (with Dye)

25 μL

Primer F (10 μM)

2 μL

Primer R (10 μM)

2 μL

裂解产物

2~5 μL

ddH2O

Up to 50 μL

· 各组分使用前应充分混匀。

· PCR扩增体系中引物终浓度为0.2~0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时,可在0.1~0.5 μM范围内调整引物终浓度。

· 裂解产物加入量不应超过PCR反应总体积的1/10;

· 配制好PCR反应体系,置于涡旋仪上涡旋混匀,然后瞬时离心将反应液集于管底。

 

3.PCR反应程序设定

 

Stage

程序 

温度 

时间 

循环 

Stage 1

预变性 95℃ 5 min 1 cycle

Stage 2

循环反应  95℃ 15 sec 35 cycles
55 ~ 72℃ 15 sec
72℃ 30 sec/kb

Stage 3

彻底延伸 72℃ 5 min 1 cycle

b.退火温度需要根据引物Tm值进行调整,一般设置为低于引物Tm值2~5℃即可。

 

4.PCR产物电泳

PCR扩增反应结束后直接取3~5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。本产品中已经预混有电泳缓冲液和染料,因此扩增产物无需再添加DNA Loading Buffer。

 

常见问题解答

Q1: 24601试剂盒中的Proteinase K的储存条件?

A1:Proteinase K储存条件为4℃,若长期不使用(三个月以上)建议-20℃保存。

 

Q2: 24601试剂盒能否做其他物种?

Q2:确定可以做大鼠和小鼠。其他昆虫、哺乳动物也可以,但不能保证实验结果。

 

Q3:使用24601,裂解孵育后小鼠组织形态没变,是否裂解成功?

A3:鼠尾、鼠趾、鼠耳等组织裂解后形态没变属于正常现象,裂解液加热孵育后已经有大部分基因组DNA释放出来。

 

Q4:95℃加热后裂解液变浑浊,且颜色偏白,该现象是否正常?

A4: 这是正常现象,不影响后续PCR扩增。

 

Q5: 24601裂解组织后的裂解液可以用NanoDrop测DNA浓度吗?

A5:不可以,因为裂解组织获得的裂解液成分比较复杂,包括buffer、Proteinase k,且基因组DNA的浓度低,NanoDrop测量的浓度偏高。

 

Q6:使用24601做多重PCR,扩增效果差,如何优化?

A6:引物之间会互相干扰,建议单独扩增,若单独扩增条带特异,建议调整引物间使用比例,适当调整退火温度,同时,适当延长退火时间(30 sec-1 min)。如果需重新设计引物时,在保证引物特异性的前提下,使引物之间的Tm值尽量接近,差值不要太大(2-3℃)。

 

Q7:使用24601裂解小鼠组织效果不好时,有何建议?

A7:
(1)建议增大组织的裂解量,并延长孵育时间;
(2)建议优化PCR反应体系、反应程序。

 

Q8:扩增产量低或者无法扩增

A8:
(1)PCR反应中加入的裂解液过量或裂解液中混入了PCR抑制物:减少裂解液用量;或将裂解产物稀释10倍后再进行PCR扩增;或增大PCR反应体系;
(2)模板加入量不适合:裂解产物用量不应超过PCR反应总体积的1/10;
(3)DNA释放效率较差:可尝试延长55℃孵育时间至3h;
(4)Proteinase K没有充分灭活:延长95℃灭活时间或在沸水浴中进行灭活;
(5)PCR循环数不够:增加PCR循环数以获得更好的扩增效果;
(6)循环反应退火温度设置太高:降低退火温度(每次降低3℃);
(7)PCR引物错配:重新设计引物,并添加已纯化过的小鼠基因组为模板的阳性对照;
(8)样本裂解混合液保存不当或保存时间过久,DNA 基因组已经降解:裂解混合液可在4℃保存2~3天,或-20℃存放3个月;
(9)PCR 试剂保存不当失去活性:试剂盒应保存于-20℃,使用时避免反复冻融。若使用频繁,可在4℃短时间存放。

 

Q9:非特异性扩增

A9:
(1)引物浓度过高:降低引物浓度。
(2)PCR引物错配:重新设计引物;引物3’端最后一个碱基选择C或G;最后8个碱基应避免出现连续错配;引物3’端尽量避免出现发夹结构;引物Tm值控制在60℃-72℃之间,GC含量控制在40%-60%之间,且正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。
(3)PCR扩增反应退火温度设置太低:提高退火温度(每次提高2℃);
(4)PCR循环数过多:减少循环数。
(5)PCR反应体系在室温下配置:冰上配置反应体系可显著降低非特异性扩增。

 

Q10: 阴性对照出现扩增

A10:
(1)PCR反应体系出现污染:逐个更换PCR反应体系中的每一个组分;
(2)操作工具污染:实验所有试剂或器材均应高温高压灭菌。

 

产品说明书

#24601 One Step Mouse Genotyping Kit Manual

pdf

927.4KB

参考文献

COA查询

%{tishi_zhanwei}%

相关产品