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24305 2 × Ezmax® Universal CloneMix
产品概述
产品描述
2 × Ezmax® Universal CloneMix是基于同源重组原理开发的一步法单片段/多片段通用型无缝克隆试剂盒，Ezmax®系列重组克隆试剂盒属于非连接酶依赖型体系，载体自连背景极低。高度优化的2 × Ezmax® Universal CloneMix预混了增强型重组酶和重组反应所需缓冲液，可显著提高克隆的重组效率及对杂质的耐受程度，因此制备的高纯度线性化载体和插入片段可不纯化直接用于重组克隆，大大简化了实验操作。
本试剂盒可以将含有载体末端重叠区域的插入片段定向重组至任何载体的任何位点，不受酶切位点限制（特殊情况，如有毒基因的克隆或插入外源DNA后导致质粒本身不稳定等除外），可以插入单个片段，也可以一次插入多至5个顺序拼接的片段，载体末端与插入片段末端以及相邻插入片段末端之间需要15～25 bp能够相互同源重组的完全一致的序列。插入片段和线性化载体在重组酶作用下，仅需37℃反应5～30 min即可完成重组，重组产物不依赖连接酶直接转化至感受态细胞，所获得的阳性克隆率在95%以上。
产品优势
✽ 简单快速：一管式Mix体系，操作快捷简便，仅需37℃反应5～20 min即可实现快速重组。
✽ 高效：显著提高了克隆的重组效率及对杂质的耐受程度，可高效克隆50 bp～10 kb片段，阳性率>95%。
✽ 高度兼容性：可进行单片段同源重组、1~5个片段的快速无缝克隆、定点突变和高通量克隆等实验。
实验案例
1. 克隆转化效率高，背景信号低，重组产物转化后平板上一般可形成数千个克隆，而无插入片段的阴性对照反应转化后只有数个单克隆形成，
2. 菌落PCR验证:三个多片段重组，挑取24个单克隆菌落PCR验证，分别验证三个外源片段，菌落PCR结果表示克隆阳性率可到95%以上。
实验流程
1.制备线性化载体
在目标载体上选择合适的克隆位点，对克隆载体进行线性化处理。建议尽量选择无重复序列、无高级结构且GC含量在40%～65%之间的区域。常用载体线性化方法有以下2种：
1.1 酶切法制备线性化载体
针对较大的载体且有合适的酶切位点时，建议使用酶切法。其中，双酶切比单酶切的效果更好。双酶切方法使载体线性化更完全，降低转化背景（假阳性克隆）；若使用单酶切线性化，需要适当延长酶切时间以减少环型质粒残留，降低转化背景。建议酶切后取少量酶切产物进行电泳，以确保全部载体被切开。平末端和粘性末端均可。
◆ Ezmax® Universal CloneMix重组反应体系内无DNA连接酶，不会引发载体自连。因此，即使是单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理。重组产物转化后出现的假阳性克隆(无插入片段)，绝大部分是由未线性化环型载体转化形成。如果假阳性克隆比例较高，推荐重新制备线性化载体。
◆ 酶切完成后，应快速将内切酶65°C，20 min灭活，或对目的产物纯化后用于后续的无缝拼接反应。
1.2 反向PCR扩增法制备线性化克隆载体
建议使用高保真DNA聚合酶进行载体的扩增以降低扩增突变的引入。本试剂盒与常规PCR的反应体系兼容；因此，如果PCR产物条带单一，则可直接用于后续的重组反应。如果PCR扩增产物有杂带，则应将PCR产物进行电泳以及胶回收纯化后再用于无缝拼接，以提高产物纯度并去除一部分未线性化的环型载体，有利于提高重组效率。
◆ 线型DNA序列作为模板时无需去除原本的模板；而环型质粒作为模板时则需要去除，可利用抽提模板带有甲基化修饰的特点，使用Dpn I酶切进行去除。
2.制备外源DNA插入片段
2.1 设计用于扩增外源DNA片段的引物
插入片段扩增引物由两部分构成：同源序列+特异性引物，即在插入片段的正/反向引物的5-端引入同源序列，使扩增产物之间以及扩增产物与线性化克隆载体之间都具有能够相互同源重组的完全一致的序列(15～25 bp，不包括酶切位点)。通常在引物的5'-端引入与线性化克隆载体末端一致的DNA序列，长度一般选择18 bp，也可在15～25 bp之间进行调整。多片段克隆时需保持相邻插入片段末端同源性。
Primer F插入片段正向扩增引物设计方式：
5'-上游载体末端同源序列+酶切位点（可选）+基因特异性正向扩增引物序列-3'
Primer R 插入片段反向扩增引物设计方式：
5'-下游载体末端同源序列+酶切位点（可选）+基因特异性反向扩增引物序列-3'
◆ 基因特异性正/反向扩增引物序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列，Tm值60 ~ 65℃为佳；
◆ 上/下游载体末端同源序列即线性化载体最末端序列(用于同源重组)，GC含量40% ~ 60%为佳。
◆ 计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，引入的同源序列及酶切位点不应参与计算。
◆ 引物序列合成时推荐选择PAGE纯化方式，有利于提高克隆效率。
具体引物设计，可参照以下示例：
◆ 示例一：单个插入片段扩增引物设计（以Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切线性化载体为例）
◆ 示例二：多个插入片段扩增引物设计（以Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切线性化载体）
2.2 PCR扩增外源DNA片段
建议使用高保真DNA聚合酶进行外源DNA片段的扩增；无需考虑产物末端是否有A加尾，不影响最终的拼接准确性和拼接效率。与载体制备的流程类似，如果外源DNA的PCR扩增条带单一，则可以不用纯化，直接用于后续的拼接反应。但PCR扩增产物纯度较低时，建议进行胶回收纯化，有利于提高重组效率。
◆ 如果用于制备外源DNA的模板为环型质粒，且抗性和后续待拼接载体的抗性相同，则残留的外源质粒模板会导致大量的转化背景，影响目标克隆的挑选，因而需要去除质粒模板；可通过电泳法胶回收目的片段或者通过Dpn I酶切法去除带有甲基化修饰的环型质粒。
3.重组反应
冰上配置反应体系，37℃反应5～30 min（1~2个插入片段设置5～15 min；3~5个插入片段设置15～30 min）。反应结束后，将反应产物置于冰上5 min以终止反应。反应产物可直接用于转化实验或冻存于-20℃备用。
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组分 |
体积 |
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2 × Ezmax® Universal CloneMix |
10 μL |
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线性化载体 |
20 ng/kb (最低40 ng) |
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外源DNA插入片段 |
40 ng/kb (最低20 ng/每片段) |
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ddH2O |
Up to 20 μL |
◆ 建议设置阴性对照，即上述体系不加2 × Ezmax® Universal CloneMix；若负对照长出很多克隆，则说明在载体制备或外源插入片段制备过程中存在载体未线性化完全、外源片段扩增模板质粒未去除彻底等问题，需要重新制备或纯化。
◆ 推荐载体和外源插入片段的最佳摩尔比是n（载体）：n（插入片段）=1：2；推荐直接用片段长度来计算用量，无需算摩尔浓度，以4 kb长度的载体为例，使用量为20 ng/kb×4 kb=80 ng，低于2 kb的载体取最低使用量40 ng；以1 kb长度的插入片段为例，使用量为40 ng/kb×1 kb=40 ng，低于0.5 kb的外源插入片段取最低使用量20 ng。
◆ 建议使用PCR仪等温控较精准的仪器反应，反应温度或反应时长相差太大都会影响克隆的效率。
4.重组产物转化
1）冰上解冻克隆用感受态细胞（如：DH5α Competent cell，#CC96102）等。
2）取上述反应液10 μL加入100 μL感受态细胞中，轻轻混匀，冰上静置30 min。
3）42℃水浴热激90 sec后，立即置于冰上冷却2～5 min。
4）加入900 μL SOC或LB液体培养基 (不添加抗生素)，37℃摇菌复壮45 min。
5）将复壮后的菌液用5000 rpm离心5 min，弃掉800 μL上清，并用剩余培养液将菌体重悬，用无菌涂布棒将菌液涂布在含有正确抗性的平板上，于37℃培养箱中倒置培养12～16 h。
6）平板上长出的克隆可以使用“菌落PCR的方法”进行快速鉴定。针对阳性克隆，可根据实验需求进行进一步的序列测定。
◆ 重组产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的1/10。
5.阳性克隆鉴定
1）菌落/菌液PCR鉴定：用枪头挑取单菌落至10 μL无菌水中混匀后取1 μL为模板，或直接蘸取菌落至 PCR体系中扩增（建议至少使用一条通用引物，避免假阳性结果）；
2）以质粒为模板PCR鉴定：挑取单克隆至含相应抗生素的LB培养基中，37℃，220 rpm过夜摇菌后抽提质粒作为模板，可使用载体通用引物或特异性引物扩增；
3）酶切鉴定（若有需要）：挑取单克隆至含相应抗生素的LB培养基中，37℃，220 rpm过夜摇菌后抽提质粒，使用相应内切酶酶切质粒后电泳检测片段大小；
4）测序：建议使用载体通用引物测序鉴定。
产品组分
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组分 |
24305 (50 rxns) |
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● 2 × Ezmax® Universal CloneMix |
500 μL |
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● Control ( Linearized plasmid + Insert fragment, Ampr ) a |
40 μL |
a.阳性对照Control中包含了4.6 kb的线性化载体和1 kb的插入片段，Amp抗性。使用时直接取10 μL Control加入10 μL 2× Ezmax® Universal CloneMix,，即组成20 μL重组反应体系。
保存条件
-20℃储存，≤ 0℃运输；
常见问题解答
Q1：引物如何设计？
A1:
引物由三部分组成：同源臂（15-25 bp，不计算酶切位点和残留碱基，GC含量40%-60%）+酶切位点（按需保留或舍弃）+特异性引物（引物Tm值由特异性序列决定，计算不包括同源臂和酶切位点的序列）。
载体的线性化方式有三种：双酶切、单酶切和反向PCR，优先选择双酶切。
Q2: 平板上长不出克隆或克隆数目少
A2:
2.1 引物设计不正确：即同源臂序列选择不合适，应避免选择含有高级结构的同源序列。同源臂的大小应为15-20 bp（不包括酶切位点），且GC含量应在40%-60%。同源臂的长度小于13 bp或者大于35 bp时，基本没有重组活性，长度大于25 bp时重组效率明显下降。
2.2 载体和外源DNA纯度较低：酶切或PCR扩增获得的载体/外源DNA片段应胶回收纯化，纯化的DNA应直接溶解于ddH2O中。
2.3 载体和外源DNA的摩尔比不佳：使用更精准的方法进行外源DNA和载体的定量（用Nanodrop的方法或琼脂糖凝胶电泳的方法进行定量），建议外源DNA片段：载体的摩尔比=2：1最佳。
2.4 感受态转化效率低：使用高效感受态（108 CFU/μg以上），并将转化产物全部涂平板。
2.5 平板配置错误：选择错误的抗生素或在固体LB培养基中加入了过量抗生素。涂板时检查载体的抗性并选择正确的抗生素和浓度。
2.6 设置阳性对照：用于排查是否因操作原因、感受态效率下降、试剂酶活力下降而导致的重组效率低。
2.7 实验反应条件：建议在PCR仪或者金属浴等仪器上进行反应，温度不准会导致重组效率下降。
2.8 反应体系不合适：建议20 μL反应体系，若直接使用酶切产物或PCR产物进行重组反应时，添加的体积不用超过重组反应总体积的1/5，否则会降低重组效率。
2.9 转化体积过量：重组产物的转化体积不应该超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率。
Q3：阳性对照不长克隆或长得很少
A3：
3.1 抗性使用错误：24305试剂盒提供的对照载体的抗性为Amp+抗性。
3.2 感受态转化效率低：确保感受态转化效率＞107 cfu/μg，即将1 ng质粒转化至100 μL感受态细胞中，取1/10进行涂板，生长1000个菌斑，估算感受态转化效率为107 cfu/μg；
3.3 转化体系不合适：重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率。
Q4：假阳性/空载体/测序无信号
A4
4.1 载体线性化处理不完全：通过阴性对照检测载体是否线性化完全，如果阴性对照长了很多克隆，可能是模板加入量过多或线性化处理不完全，可优化酶切体系，提高限制内切酶使用量并延长酶切反应时间；或者更换效率更高的限制性内切酶；胶回收酶切产物。回收产物溶解于ddH2O中。
4.2 环型质粒作为PCR扩增模板增加假阳性：使用Dpn I除去含有甲基化修饰的模板（例如从DH5ɑ、DH10B等细胞中抽提的质粒模板），模板投入量不宜过多(<1 ng)，否则可能导致Dpn I消化不完全从而造成假阳性；胶回收酶切产物。回收产物溶解于ddH2O中。
4.3 连入非目的片段：PCR扩增获得外源DNA片段时，产生非特异片段，建议胶回收PCR产物，回收产物溶解于ddH2O中。
Q5：大多数克隆含有不正确片段
A5
5.1 PCR扩增外源片段不特异：优化PCR扩增体系，提高特异性；胶回收PCR产物；重新设计引物；挑取更多的克隆鉴定。
5.2 反应体系中混入相同抗性的质粒：PCR扩增模板为环状质粒时，扩增产物应进行Dpn I处理或胶回收纯化。
5.3 反应体系中混入了其它序列：进一步纯化PCR产物，排除PCR产物不纯等因素造成的影响；使用干净的耗材，ddH2O等，避免试剂或耗材带来的污染。
5.4 测序样本数太少：需要多挑几个样本测序。
Q6：菌落或菌液PCR无条带
A6
6.1 PCR体系或程序不合适：没有目的条带也没有空载体条带，建议优化PCR体系、程序，同时设置阳性对照，以质粒作为PCR模板，排除人为配置体系错误可能性。或通过酶切验证是否插入外源片段。
6.2 重组反应失败：只有空载体的条带，说明重组反应失败。载体线性化不完全，建议优化酶切体系、延长酶切时间；检查引物设计等。
6.3 引物不正确：重新设计引物，若同源臂的长度小于13 bp或者大于35 bp，基本没有重组活性，长度大于25 bp，重组效率会有明显下降。或使用通用引物验证。
Q7：插入片段出现碱基突变
A7
7.1 PCR扩增过程发生突变：建议使用高保真的DNA聚合酶。
7.2 测序样本数 :如只测试一个样本，结果不一定可信，应多测试几个样本。
7.3 测序结果分析：检查突变处的测序信号是否正常，若为杂峰或双峰则不可信。
7.4 突变位置：若同源臂处发生碱基突变，考虑是引物合成问题，建议多挑取几个样本测序，或重新合成引物进行实验。
参考文献
COA查询
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