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22204 2 × Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal)
产品概述
产品描述
本产品是使用SYBR Green I嵌合荧光法进行qPCR反应的专用预混液。核心组分PureTaq DNA Polymerase为一种新型的抗体法修饰的热启动DNA聚合酶，具有特异性强、检测灵敏度高等诸多优点，配以针对qPCR优化的最适反应缓冲液，非常适合于进行高特异性、高灵敏度的qPCR反应。本产品是一种含有qPCR反应最适浓度SYBR Green I的2 × 预混试剂，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，靶基因定量准确、重复性好、可信度高。本产品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适用于所有型号的qPCR仪器，无需在不同的机型上调整ROX的浓度，只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增，操作简便。
产品优势
✽ 广泛的平台适用性：含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适用于所有型号的qPCR仪器，无需根据不同仪器调整ROX浓度。
✽ 优异的扩增特异性和灵敏度：核心组分PureTaq DNA Polymerase为一种新型的抗体法修饰的热启动DNA聚合酶，配以针对qPCR优化的最适反应缓冲液，非常适合于进行高特异性、高灵敏度的qPCR反应。
✽ 宽广的适用范围：含有qPCR反应最适浓度SYBR Green I的2 ×预混试剂，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，靶基因定量准确、重复性好、可信度高。
✽ 程序兼容性：可用标准程序和快速程序定量，解决程序的兼容性。
实验案例
分别使用ToloBio #22204与竞品Supplier A、Supplier B，对不同模板类型（耻垢分枝杆菌、HEK293T细胞等）进行浓度梯度稀释，用双链DNA染料SYBR实时监测qRCR扩增，比较在相同引物和模板条件下的扩增情况，包括扩增灵敏度、扩增线性和扩增平台。结果显示，ToloBio #22204在不同浓度模板（1～256 pmol）条件下扩增性能稳定、优异。
实验流程
1.在qPCR管中配制如下反应体系
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组分 |
体积 |
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2 x Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal) |
10 μL |
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Primer F (10 μM) |
0.4 μL |
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Primer R (10 μM) |
0.4 μL |
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Template DNA/cDNA |
x μL |
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ddH2O |
Up to 20 μL |
反应体系中各成分的量可根据以下原则自行调整：
◆ —般来说反应体系中引物终浓度为0.2 mM即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时，可以在终浓度范围0.1-1.0 μM内调整引物浓度。
◆ qPCR灵敏度极高，建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响。推荐将模板稀释后加入反应体系中，这样可以有效提高实验的准确度。
◆ 如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。
2.按下列反应程序进行qPCR反应
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Stage |
程序 |
温度 |
时间 |
循环 |
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Stage 1 |
预变性 a |
95℃ |
30 sec |
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Stage 2
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循环反应 b
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95℃ |
10 sec |
40 cycles
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60℃ |
30 sec |
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Stage 3 |
熔解曲线 c |
仪器默认程序 |
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a. 该预变性条件适合绝大多数扩增反应，如模板结构复杂，可将预变性时间延长至3 min，以提高预变性效果。
b. 在60℃延伸阶段进行荧光信号采集；对于300 bp以内的扩増子，延伸时间设置为30 sec即可；超过300 bp的扩增子，推荐延长延伸时间至60 sec。
c. 仪器类型不同，熔解曲线采集程序不尽相同，推荐使用仪器默认熔解曲线采集程序即可。
产品组分
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组分 |
22204 (500 rxns) |
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○ 2 × Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal) |
5 × 1 mL |
组分中已包含 dNTP、Mg2+、PureTaq DNA Polymerase、SYBR Green I、ROX Passive Reference Dye等。
保存条件
-20℃避光保存，≤ 0℃避光运输；
常见问题解答
Q1: 扩增曲线形状异常
A1:
1.1扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。
1.2扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于Ct值。减小基线终点（Ct值减4），重新分析数据。
1.3个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡。处理样本时要注意离心，进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。
Q2: 反应结束无扩增曲线出现
A2:
2.1 反应循环数不够：一般设置循环数为40, 但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。
2.2确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
2.3确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解的可能。
2.4模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
2.5模板降解：重新制备模板，重复实验。
Q3: Ct值出现太晚
A3:
3.1 扩增效率极低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计合成引物。
3.2 板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
3.3 模板降解：重新制备模板，重复实验。
3.4 PCR产物太长：推荐PCR产物长度为80-150 bp。
3.5 体系中存在PCR抑制剂：一般为模板带入，加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。
Q4: 阴性对照出现明显扩增
A4:
4.1 反应体系污染：更换新的Master Mix、水、引物重复实验。反应体系在超净工作台内配置，减少气溶胶污染。
4.2 引物二聚体的出现：配合熔解曲线进行分析。
Q5: 绝对定量时标准曲线线性关系不佳
A5:
5.1 加样误差：提高模板稀释倍数，提高加样体积。
5.2 标准品降解：重新制备标准品，重复实验。
5.3 模板浓度太高：提高模板稀释倍数。
Q6: 熔解曲线出现多峰
A6:
6.1 引物设计不优：根据设计原则设计合成新的引物。
6.2 引物浓度太高：适当降低引物浓度。
6.3 cDNA模板带有基因组污染：重新制备cDNA模板。
Q7: 实验重复性差
A7:
7.1 加样体积不准：使用性能较好移液器或将模板多倍稀释后再提高加入反应体系的模板体积。
7.2 定量PCR仪不同位置温度控制不一致：定期校准仪器。
7.3 模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。
参考文献
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