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22112 miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop)
产品概述
产品描述
miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）是miRNA cDNA第一链合成的专用试剂盒(茎环法)。其中包含42℃, 2min的基因组DNA去除步骤，操作简便，可快速消除基因组DNA的干扰。本产品包含新一代逆转录酶ToLoScript III RTase以及针对miRNA的基因组去除与逆转录反应优化的最适缓冲液，从而有利于miRNA特异性逆转录产物的生成。建议使用ToloBio通用型2 × Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal，#22204)进行cDNA产物后续定量。
产品优势
✽ 优异的线性关系：在一定的模板区间内具有优异线性关系，模板含量最低检测限可低至pg级。
✽ 最适的反应体系：含有针对新一代逆转录酶ToLoScript III RTase，以及miRNA的基因组去除与逆转录反应优化的最适缓冲液，更有利于miRNA特异性逆转录产物的生成。
实验案例
以293T细胞的miRNA的10倍稀释梯度（1μg~10 pg）为模板，使用Tolobio#22112以及Supplier A，按照各自说明书推荐程序进行逆转录反应，得到的cDNA使用2 × Q3 SYBR qPCR Master Mix(Tolobio #22204)扩增hsa-miR-19a基因。实验结果显示，在一定的模板区间内，本产品相比于同类产品具有优异的线性关系。
实验流程
1.基因组DNA去除
1.1去除gDNA反应体系
室温融化5 × miR gDNA Erase-Out Mix、10 × miR RT Buffer (stem)及ToLoScript III miR Enzyme Mix (stem) 后置于冰上，在RNase-free离心管中配制如下反应体系：
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组分 |
体积 |
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5 × miR gDNA Erase-Out Mix |
2 μL |
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Total RNA/miRNA |
x μL(10 pg ~ 1 μg) |
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RNase-free ddH2O |
Up to 10 μL |
用移液器吹打混匀后短暂离心。
1.2 去除gDNA反应程序
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温度 |
时间 |
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42℃ |
2 min |
2.第一链cDNA合成
2.1第一链cDNA合成反应体系
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组分 |
体积 |
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第1步的反应液 |
10 μL |
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Stem-loop Primer (2 µM) |
1 μL |
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10 × miR RT Buffer (stem) |
2 μL |
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ToLoScript III miR Enzyme Mix (stem) |
1 μL |
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RNase-free ddH2O |
Up to 20 μL |
用移液器吹打混匀后短暂离心。
2.2第一链cDNA合成反应程序
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温度 |
时间 |
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25℃ |
5 min |
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50℃ |
15 min |
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85℃ |
2 min |
逆转录产物可直接进行下游qPCR检测。若短期内不进行下游实验，可-20℃保存。若需长期保存，建议分装后保存于-80℃，避免反复冻融。
产品组成
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组分 |
22112 (50 rxn) |
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● 5 × miR gDNA Erase-Out Mix |
100 μL |
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● 10 × miR RT Buffer (stem) a |
100 μL |
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● ToLoScript III miR Enzyme Mix (stem) b |
50 μL |
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○ RNase-free ddH2O |
1 mL |
a.包含dNTP；
b.包含ToLoScript III RTase, RNase inhibitor。
保存条件
-20℃保存，≤ 0℃运输；
常见问题解答
Q1: 如果要研究多个miRNA定量实验，是不是每个miRNA均要单独设计一条茎环引物进行逆转录？
A1: 是的，针对每个miRNA都要设计一条茎环逆转录引物，一管反应中只能逆转一个miRNA（内参也是一样），即不同逆转录引物均需要分管逆转录。如一次性测试miRNA种类多，推荐使用加A尾法（Tolobio #22113，miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by tailing A)。
Q2: miRNA为什么要合成茎环引物？
A2:因为miRNA较短，如果使用普通逆转录和定量方法，无法设计定量引物，需要在逆转录阶段将cDNA延长。
参考文献
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