22108 ToloScript II All-in-one RT EasyMix for qPCR
产品概述
产品简介
本试剂盒是优化升级的一步法逆转录试剂盒，可在同一管中同时进行基因组DNA去除和逆转录两个反应，操作简便，并可有效降低多步骤操作过程中造成的样品污染和RNA降解的风险。本试剂盒中包含的新一代逆转录酶ToloScript Reverse Transcriptase II可耐受高达60℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，配合热敏型DNase以及针对基因组去除与逆转录一步反应优化的最适缓冲体系，可适用于少量模板或低拷贝基因的逆转录。逆转录产物兼容染料法和探针法qPCR。
产品组分
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组分 |
22108-01 (100 rxns) |
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400 μL |
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100 μL |
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20 μL |
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2 × 1 mL |
5 × All-in-one RT Buffer II a
All-in-one Enzyme Mix II b
All-in-one No RT Control Mix II c
RNase-free ddH2O
a. 包含逆转录和gDNA去除反应所需的Random primers/Oligo (dT)20VN primer mix, dNTP, Buffer;
b. 包含逆转录和gDNA去除反应所需的ToloScript Reverse Transcriptase, DNase, RNase Inhibitor;
c. 除不含ToloScript Reverse Transcriptase II外，其余组分与All-in-one Enzyme Mix II相同。
● 请务必将All-in-one Enzyme Mix II和All-in-one No RT Control Mix II置于冰上！
保存条件
-20℃储存，≤ 0℃运输。
实验流程
1. 反应体系
在冰上融化各试剂组分，并充分混匀，并在RNase-free离心管中配置如下体系：
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组分 |
体积 |
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5 × All-in-one RT Buffer II |
4 μL |
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All-in-one Enzyme Mix II |
1 μL |
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Template RNA |
x μL (1 pg ~ 1 μg) |
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RNase-free ddH2O |
Up to 20 μL |
● 请务必用移液器轻轻吹打8 ~ 10次至充分混匀，再短暂离心收集至管底。
No RT Control反应体系（可选）:
No-RT Control Mix用于配置无逆转录酶的对照，判断qPCR模板是否来自cDNA。
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组分 |
体积 |
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5 × All-in-one RT Buffer II |
4 μL |
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All-in-one No RT Control Mix II |
1 μL |
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Template RNA |
x μL (1 pg ~ 1 μg) |
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RNase-free ddH2O |
Up to 20 μL |
● 请务必用移液器轻轻吹打8 ~ 10次至充分混匀，再短暂离心收集至管底。
2. 反应程序
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温度 |
时间 |
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50℃ |
15 min |
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85℃ |
5 sec |
● 如果模板有高GC序列或复杂二级结构，可先将逆转录体系25°C反应5 min，再将反应温度提高至60°C，有助于提高产量。
● 逆转录产物可立即用于qPCR反应，或于-20℃保存，并在半年内使用；长期存放则建议分装后于-80℃保存，避免cDNA反复冻融。
注意事项
1. 所有操作均应在冰上进行，且操作过程应避免RNase污染。请保持实验区干净整洁；操作时请穿戴干净的手套、口罩，请使用RNase-free的枪头、离心管等耗材。
2. 在完成反应体系配制后，请务必进行混匀操作，否则会影响实验数据的稳定性。
3. 在20 µL逆转录反应体系中建议加入不超过1 µg的total RNA。若目的基因的反转录产物量非常低，则可以最多加入5 µg total RNA。否则，如果加入RNA量过高，可能会超出后续qPCR的线性范围。
4. cDNA产物可立即用于qPCR反应，或冻存于-20℃，并可在半年内使用。如需长期存放，则建议将逆转录cDNA产物分装后冻存于-80℃，cDNA应避免反复冻融。
5. 用于PCR反应的cDNA产物体积建议不超过PCR反应体积的1/10。建议使用ToloBio通用型2 × Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal，#22204）进行后续的荧光定量实验，该产品具有优异的扩增性能，能实现低浓度模板的稳定扩增；内含特殊的ROX Passive Reference Dye，适用于所有型号的qPCR仪器。
6. 本产品中的5 × All-in-one RT Buffer II组分冻存可能出现白色沉淀，为正常现象，可37°C快速溶解，
7. 本产品仅作科研用途。
常见问题解答
Q1：如何评判RNA质量
A1：RNA质量从两个方面进行检测：
1.1 RNA完整度。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整度。以真核生物为例，完整的总RNA有清晰的三条带（柱式RNA提取kit只有两条带，Trizol有三条带），分子量从大到小分别为28S、18S、5S，并且28S是18S亮度的两倍（理论上是2.7倍，但大多数样品提取的RNA几乎2倍也达不到。若条带清晰且比值大于1，则RNA完整性可以满足绝大部分实验需求。）；若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部分降解，此时请立即进行逆转录反应，并适量加大模板量；若只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则RNA已完全降解，需要重新提取；若10 kb附近有条带说明有gDNA污染。
1.2 RNA的纯度。RNA的纯度可以通过测定OD260/280和OD260/230两个比值判断：
OD260/280=1.8-2.2，表示纯度较高；
OD260/280 < 1.8，表示存在蛋白污染；
OD260/280 > 2.2，表示可能存在RNA降解。
注：建议使用1%的琼脂糖凝胶，210V电泳10-12min；加好loading后的RNA可以放置在PCR仪上70℃，2min，使RNA变性后再进行电泳，这样跑出来的RNA条带更好看，也更能反应RNA的完整性；
Q2：如何选择逆转录的引物
A2：逆转录三种引物：
2.1 随机引物：随机结合在RNA的任何区域，适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。
2.2 Oligo dT：适用于具有PolyA尾的RNA（原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾）。 由于Oligo dT结合在PolyA尾上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。
2.3 基因特异性引物：与模板序列互补，适用于序列已知的基因逆转录。若进行One step RT-qPCR反应时，反转录引物只能使用特异性引物。
引物选择依据：cDNA后续进行PCR扩增长片段，一般用Oligo dT或者基因特异性引物，不建议使用随机引物，因为随机引物是随机结合的，cDNA片段会偏短；cDNA后续进行qPCR，一般使用Oligo dT和随机引物的混合物，可以避免3'端的扩增偏好性。
Q3：对于逆转录加样的操作注意事项
A3：
3.1 All-in-one Enzyme Mix 及All-in-one No RT Control Mix含有高浓度的甘油，在使用前请短暂离心收集到反应管底部，并用移液枪轻轻吸打充分混匀后准确吸取。
3.2 20 µl逆转录反应体系建议加入不超过1 µg的Total RNA。如果目的基因表达量非常低，最多加入5 µg Total RNA，否则加入RNA量过高，可能会超出后续定量PCR的线性范围。
Q4：可以通过检测逆转录产物cDNA浓度判定逆转效率吗？
A4：不可以，逆转录产物cDNA是混合物，除了cDNA产物以外，还有buffer、逆转录酶、引物，同时还包含未转录的模板RNA，总RNA中的tRNA、rRNA等，都会干扰浓度测定结果，因此不能反应真实的cDNA产量；cDNA同样不可以纯化，因为逆转得到的cDNA长短不一，纯化会损失短的cDNA。
Q5：cDNA模板需要稀释吗？应该稀释多少倍进行定量？
A5：没有具体的稀释参考倍数，一般cDNA每稀释10倍CT值变大3.3，可以根据这个规律进行合适的稀释。可以使用cDNA原液、10倍稀释液、100倍稀释液作为模板进行定量实验，根据规律选择CT值落在18-28范围内的稀释倍数。也可以参考换试剂之前的稀释倍数。
注：当使用cDNA原液进行检测的时候，使用量不能超过qPCR反应体系的1/10，因为cDNA中包含很多抑制qPCR的组分，cDNA体积大时风险很高。
Q6：逆转录试剂盒可以用于lncRNA和cirRNA吗？
A6：可以，和普通的RNA逆转录类似。不过lncRNA比较长，建议在去除基因组步骤前先进行65℃ 5 min预变性，打开二级结构再进行逆转录。并不是所有的lncRNA都包含PolyA 尾，所以如果使用逆转录试剂盒，可以同时添加随机引物与Oligo dT两种引物，或者只添加随机引物一种引物，但不能只添加Oligo dT一种引物。
cirRNA为环状闭合结构，没有poly A尾，逆转录时只加随机引物。cirRNA长度跨度较大，比较长的话建议跟lncRNA一样先预变性，正常的话就按照正常程序就行了。
关于引物的选择，总的来讲：
mRNA可以选用随机引物+Oligo dT；随机引物；Oligo dT；GSP（基因特异性引物）；
cirRNA可以选用随机引物；GSP（基因特异性引物）；
lncRNA可以选用随机引物+Oligo dT；随机引物；GSP（基因特异性引物）；lncRNA在进行逆转录之前需要进行RNA预变性。
参考文献
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