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22107 ToloScript All-in-one RT EasyMix for qPCR

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22107 ToloScript All-in-one RT EasyMix for qPCR

  • 规 格:
    • 100 rxns (20 μL/rxn)

货 号:

22107


价 格:

¥ 0

¥ 1500


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产品概述

产品描述

本试剂盒是ToloScript RT EasyMix for qPCR (with 2-Step gDNA Erase-Out,#22106)的升级版本,将原来的两步法优化升级为一步法,可在同一管中同时进行基因组DNA去除和逆转录两个反应,操作简便,并可有效降低多步骤操作过程中造成的样品污染和RNA降解的风险。

本试剂盒中包含的新一代逆转录酶ToloScript Reverse Transcriptase可耐受高达60℃的反应温度,适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时,配合热敏型DNase以及针对基因组去除与逆转录一步反应优化的最适缓冲体系,可适用于少量模板或低拷贝基因的逆转录。逆转录产物兼容染料法和探针法qPCR,分别推荐ToloBio通用型2×Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal, #22204)和2×Q3 probe qPCR Master Mix (Universal, #22205),进行高性能的基因表达分析。


 

产品组分

组分

22107 (100 rxns) 

5 × All-in-one RT Buffer a

400 μL

All-in-one Enzyme Mix b

100 μL

All-in-one No RT Control Mix c 

20 μL

○ RNase-free ddH2O

2 × 1 mL

a.包含逆转录和gDNA去除反应所需的Random primers/Oligo (dT)20VN primer mix, dNTP, Buffer;

b.包含逆转录和gDNA去除反应所需的ToloScript Reverse Transcriptase, DNase, RNase Inhibitor;

c.除不含ToloScript Reverse Transcriptase外,其余组分与All-in-one Enzyme Mix相同。

· 请务必将All-in-one Enzyme Mix和All-in-one No RT Control Mix置于冰上!

 

 

保存条件

-20℃保存,≤ 0℃运输;

 

 

产品优势

简便快捷的操作:体系中包含逆转录反应所需的所有组分,只需加入模板RNA,20 min内即可同时完成去除基因组DNA和逆转录反应。

卓越的逆转录效率:含有新一代ToloScript Reverse Trscriptase,具有优越的持续合成能力

强大的兼容体系:逆转录产物兼容染料法和探针法qPCR

 

 

实验案例

分别使用ToloBio #22107与竞品Supplier A、Supplier B,对293T的RNA进行浓度梯度稀释,用双链DNA染料SYBR实时监测qPCR扩增,比较在相同引物和模板条件下的扩增情况,包括扩增灵敏度、扩增线性和扩增平台。结果显示,ToloBio #22107与竞品相比在不同浓度模板条件下扩增性能更稳定、优异。

 

 

实验流程

1.反应体系

在冰上融化各试剂组分,并充分混匀,并在RNase-free离心管中配置如下体系:

组分

体积 

5 × All-in-one RT Buffer

4 μL

All-in-one Enzyme Mix

1 μL

Template RNA

x μL (1 pg ~1 μg)

RNase-free ddH2O

Up to 20 μL

· 请务必用移液器轻轻吹打8 ~ 10次至充分混匀,再短暂离心收集至管底。

No RT Control反应体系(可选):

No-RT Control Mix用于配置无逆转录酶的对照,判断qPCR模板是否来自cDNA。

组分

体积 

5 × All-in-one RT Buffer

4 μL

All-in-one No RT Control Mix

1 μL

Template RNA

x μL (1 pg ~1 μg)

RNase-free ddH2O

Up to 20 μL

· 请务必用移液器轻轻吹打8 ~ 10次至充分混匀,再短暂离心收集至管底。

 

2.反应程序

温度

时间

50℃

15 min

85℃

5 sec

· 如果模板有高GC序列或复杂二级结构,可先将逆转录体系25°C反应5 min,再将反应温度提高至 60°C,有助于提高产量。

· 逆转录产物可立即用于qPCR反应,或于-20℃保存,并在半年内使用;长期存放则建议分装后于-80℃保存,避免cDNA反复冻融。

常见问题解答

Q1:如何评判RNA质量

A1:RNA质量从两个方面进行检测:
1.1 RNA完整度。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整度。以真核生物为例,完整的总RNA有清晰的三条带(柱式RNA提取kit只有两条带,Trizol有三条带),分子量从大到小分别为28S、18S、5S,并且28S是18S亮度的两倍(理论上是2.7倍,但大多数样品提取的RNA几乎2倍也达不到。若条带清晰且比值大于1,则RNA完整性可以满足绝大部分实验需求。);若能看见三条带,但带型模糊或弥散,则说明RNA有部分降解,此时请立即进行逆转录反应,并适量加大模板量;若只能看见分子量很小的一条带或没有条带,则RNA已完全降解,需要重新提取;若10 kb附近有条带说明有gDNA污染。
1.2 RNA的纯度。RNA的纯度可以通过测定OD260/280和OD260/230两个比值判断:
OD260/280=1.8-2.2,表示纯度较高;
OD260/280 < 1.8,表示存在蛋白污染;
OD260/280 > 2.2,表示可能存在RNA降解。
注:建议使用1%的琼脂糖凝胶,210V电泳10-12min;加好loading后的RNA可以放置在PCR仪上70℃,2min,使RNA变性后再进行电泳,这样跑出来的RNA条带更好看,也更能反应RNA的完整性;

 

Q2:如何选择逆转录的引物

A2:逆转录三种引物:
2.1 随机引物:随机结合在RNA的任何区域,适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。
2.2 Oligo dT:适用于具有PolyA尾的RNA(原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾)。 由于Oligo dT结合在PolyA尾上,所以对RNA样品的质量要求较高,即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。
2.3 基因特异性引物:与模板序列互补,适用于序列已知的基因逆转录。若进行One step RT-qPCR反应时,反转录引物只能使用特异性引物。
引物选择依据:cDNA后续进行PCR扩增长片段,一般用Oligo dT或者基因特异性引物,不建议使用随机引物,因为随机引物是随机结合的,cDNA片段会偏短;cDNA后续进行qPCR,一般使用Oligo dT和随机引物的混合物,可以避免3'端的扩增偏好性。

 

Q3:对于逆转录加样的操作注意事项

A3:
3.1 All-in-one Enzyme Mix 及All-in-one No RT Control Mix含有高浓度的甘油,在使用前请短暂离心收集到反应管底部,并用移液枪轻轻吸打充分混匀后准确吸取。
3.2 20 µl逆转录反应体系建议加入不超过1 µg的Total RNA。如果目的基因表达量非常低,最多加入5 µg Total RNA,否则加入RNA量过高,可能会超出后续定量PCR的线性范围。

 

Q4:可以通过检测逆转录产物cDNA浓度判定逆转效率吗?

A4:不可以,逆转录产物cDNA是混合物,除了cDNA产物以外,还有buffer、逆转录酶、引物,同时还包含未转录的模板RNA,总RNA中的tRNA、rRNA等,都会干扰浓度测定结果,因此不能反应真实的cDNA产量;cDNA同样不可以纯化,因为逆转得到的cDNA长短不一,纯化会损失短的cDNA。

 

Q5:cDNA模板需要稀释吗?应该稀释多少倍进行定量?

A5:没有具体的稀释参考倍数,一般cDNA每稀释10倍CT值变大3.3,可以根据这个规律进行合适的稀释。可以使用cDNA原液、10倍稀释液、100倍稀释液作为模板进行定量实验,根据规律选择CT值落在18-28范围内的稀释倍数。也可以参考换试剂之前的稀释倍数。
注:当使用cDNA原液进行检测的时候,使用量不能超过qPCR反应体系的1/10,因为cDNA中包含很多抑制qPCR的组分,cDNA体积大时风险很高。

 

Q6:逆转录试剂盒可以用于lncRNA和cirRNA吗?

A6:可以,和普通的RNA逆转录类似。不过lncRNA比较长,建议在去除基因组步骤前先进行65℃ 5 min预变性,打开二级结构再进行逆转录。并不是所有的lncRNA都包含PolyA 尾,所以如果使用逆转录试剂盒,可以同时添加随机引物与Oligo dT两种引物,或者只添加随机引物一种引物,但不能只添加Oligo dT一种引物。
cirRNA为环状闭合结构,没有poly A尾,逆转录时只加随机引物。cirRNA长度跨度较大,比较长的话建议跟lncRNA一样先预变性,正常的话就按照正常程序就行了。
关于引物的选择,总的来讲:
mRNA可以选用随机引物+Oligo dT;随机引物;Oligo dT;GSP(基因特异性引物);
cirRNA可以选用随机引物;GSP(基因特异性引物);
lncRNA可以选用随机引物+Oligo dT;随机引物;GSP(基因特异性引物);lncRNA在进行逆转录之前需要进行RNA预变性。

 

产品说明书

#22107 ToloScript All-in-one RT EasyMix for qPCR Manual

pdf

606.8KB

参考文献

COA查询

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