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21809 2 × MegaPfu Premix (with dye)

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21809 2 × MegaPfu Premix (with dye)

  • 规 格:
    • 1 mL
    • 5×1 mL
    • 15×1 mL

货 号:

21809


价 格:

¥ 0

¥ 600


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产品概述

产品描述

2 × MegaPfu Premix (with dye)是一种即用型高保真 PCR 预混液,含有 MegaPfu DNA polymerase、buffer、dNTP Mixture 以及稳定剂等。使用时,只需在制品溶液中加入模板和引物便可进行 PCR 反应,大大简化了操作过程,降低了 PCR 操作过程中污染的风险。本产品中使用的 MegaPfu DNA Polymerase 具有 5'→3'方向的 DNA 聚合酶活性和 3'→5'的 DNA 外切酶活性,能纠正 DNA 扩增过程中产生的碱基错配,是一款高保真 PCR 快速反应酶。使用本品扩增得到的 PCR 产物为平末端,若做 TA 克隆需加 A 处理后再与 T 载体连接。本产品扩增产物可适用于 2 × Ezmax® Universal CloneMix (ToloBio #24305)。产品中已添加染料,扩增产物可直接用于电泳检测。

 

 

产品组分

组分

21809-01 

21809-02 21809-03

○ 2 ×  MegaPfu Premix (with dye)

1 mL 5 × 1 mL 3 × 21809-02

 

 

保存条件

-20℃储存,≤ 0℃运输。

 

 

产品优势

高保真度:MegaPfu DNA Polymerase是新一代的高保真DNA聚合酶,具有5'→3' DNA聚合酶活性和3'→5' 的核酸外切酶活性,能纠正DNA扩增过程中产生的碱基错配,其保真度比普通Pfu提高了8-10倍。

操作简便:反应体系只需加入引物和模板即可进行PCR扩增,简化了实验操作步骤并减少了人为误差,提高了实验通量和结果的可重复性。

稳定性好:产品含有特异保护剂,使得预混液反复冻融后仍可维持稳定活性。

 

 

实验流程

1.反应体系

组分

体积 

2 × MegaPfu Premix

25 μL

Primer F (10 μM)

2 μL

Primer R (10 μM) 

2 μL

Template DNA a 

x μL

ddH2O

Up to 50 μL

· MegaPfu DNA聚合酶在室温下也有一定的反应活性,在冰上配制可减少准备过程中发生的非特异扩增,有助于提高反应的特异性。

a.针对不同来源或类型的模板,所需的反应浓度不同,下表为50 µL反应体系推荐模板使用量:

模板种类

模板起始量

动植物基因组DNA

0.1-1 µg

大肠杆菌基因组DNA

10-100 ng

cDNA

1-5 μL(不超过PCR反应总体积的1/10)

质粒DNA

0.1-10 ng

λDNA

0.5-10 ng

 

2.反应程序

温度

程序

温度

时间 

循环

Stage 1

预变性

95℃

2 min 1 cycle
Stage 2

变性

95℃

15 sec 30-35 cycles

退火

55℃ 

15 sec

延伸 

72℃ 

30 sec/kb

Stage 3

彻底延伸

72℃ 

5 min 1 cycle

· 退火温度需根据引物和模板实际的GC含量来作调整。

 

常见问题解答

Q1: 无产物或产物量少

A1:
1.1 引物:优化引物设计。
1.2 退火温度:设置退火温度梯度,找到合适的退火温度。
1.3 引物浓度:适当提高引物浓度。
1.4 延伸时间:适当增加延伸时间至10-15 sec/kb。
1.5 循环数:增加循环数至36-40个循环。
1.6 模板纯度:使用高纯度模板。
1.7 模板使用量:使用量参照反应体系推荐量调整并适当增加。

 

Q2: 有杂带或弥散条带

A2:
2.1 引物:优化引物设计。
2.2退火温度:尝试提高退火温度并设置退火温度梯度。
2.3引物浓度:适当降低引物浓度。
2.4循环数:减少循环数至25-30个循环。
2.5反应程序:使用两步法或Touch down PCR程序。
2.6模板纯度:使用高纯度模板。
2.7模板使用量:使用量参照反应体系推荐量调整并适当减少。

 

Q3: 样本量少

A3:
3.1直接PCR:简化实验流程,减少动手操作的时间,同时可以避免纯化过程中DNA的损失。
3.2梯度PCR:找到最优退火温度,并进一步一次退火温度进行普通PCR。

 

Q4: 特异性扩增

A4:
4.1降落PCR:与温度梯度PCR相比,降落PCR更有优势,降落PCR只需一次就可以获得很好的扩增效果,避免了对每对引物进行最佳复性温度的优化和测定工作,并且降落PCR在很大程度上减弱了仪器性能对扩增效果的制约。
4.2巢式PCR:巢式PCR是一种变异的聚合酶链式反应(PCR),采用两对(而非一对)PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通 PCR相似。第二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次PCR扩增片段的内部)结合在第一次PCR产物内部,特异性的扩增位于首轮PCR产物内的DNA片段。 如果第一次扩增产生了错误的片断,那么第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率会极低。因此,巢式PCR的扩增非常特异。

 

Q5:引物二聚体

A5:
5.1模板:模板纯度低,纯化模板。
5.2 dNTP、镁离子浓度过高:减少dNTP用量,摸索镁离子浓度。
5.3循环次数过多:减少循环次数。

 

Q6: 实验重复性差

A6:
6.1加样体积不准:使用性能较好移液器或将模板多倍稀释后再提高加入反应体系的模板体积。
6.2 PCR仪不同位置温度控制不一致:定期校准仪器。
6.3模板浓度太低:模板浓度越低,重复性越差,减少模板稀释度或提高加样体积。

 

产品说明书

#21809 2 × MegaPfu Premix(with dye) Manual

pdf

558.8KB

参考文献

COA查询

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