21808 2 × MegaPfu Premix-吐露港生物-基于CRISPR创新科技，解决全球健康威胁！

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21808 2 × MegaPfu Premix

规格：
- 1 mL
- 5×1 mL
- 15×1 mL

货号：

21808

价格：

¥ 0

¥ 600

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产品概述

产品描述

2 × MegaPfu Premix是一种即用型高保真PCR预混液，包含MegaPfu DNA Polymerase，dNTP以及优化的缓冲体系。其中MegaPfu DNA Polymerase是新一代的高保真DNA聚合酶，具有5'→3' DNA聚合酶活性和3'→5' 的核酸外切酶活性，能纠正DNA扩增过程中产生的碱基错配，其保真度比普通Pfu提高了8-10倍，扩增速度可达15 sec/kb。
2 × MegaPfu Premix具有高保真度、高产量、扩增速度快、操作简便、稳定性好等优势，反应体系只需加入引物和模板即可进行PCR扩增，简化了实验操作步骤并减少了人为误差，提高了实验通量和结果的可重复性。另外，该产品还含有特异保护剂，使得预混液反复冻融后仍可维持稳定活性。使用本品扩增得到的PCR产物为平末端，可加A处理或使用平末端克隆载体，无缝克隆推荐使用ToloBio开发的单片段/多片段通用型2 × Ezmax^® Universal CloneMix（#24305）同源重组试剂盒。本产品中不含染料，PCR产物需加入Loading Buffer 后进行电泳。

产品优势

✽ 高保真度：MegaPfu DNA Polymerase是新一代的高保真DNA聚合酶，具有5'→3' DNA聚合酶活性和3'→5' 的核酸外切酶活性，能纠正DNA扩增过程中产生的碱基错配，其保真度比普通Pfu提高了8-10倍。
✽ 极速扩增：扩增速度可达15 sec/kb。
✽ 操作简便：反应体系只需加入引物和模板即可进行PCR扩增，简化了实验操作步骤并减少了人为误差，提高了实验通量和结果的可重复性。
✽ 稳定性好：产品含有特异保护剂，使得预混液反复冻融后仍可维持稳定活性。

实验流程

1.反应体系

组分	体积
2 × MegaPfu Premix	25 μL
Primer F (10 μM)	2 μL
Primer R (10 μM)	2 μL
Template DNA ^a	x μL
ddH₂O	Up to 50 μL

◆ MegaPfu DNA聚合酶在室温下也有一定的反应活性，在冰上配制可减少准备过程中发生的非特异扩增，有助于提高反应的特异性。

a.针对不同来源或类型的模板，所需的反应浓度不同，下表为50 µL反应体系推荐模板使用量：

模板种类	模板起始量
动植物基因组DNA	0.1-1 µg
大肠杆菌基因组DNA	10-100 ng
cDNA	1-5 μL(不超过PCR反应总体积的1/10)
质粒DNA	0.1-10 ng
λDNA	0.5-10 ng

2.反应程序

Stage	程序	温度	时间	循环
Stage 1	预变性	95℃	2 min	1 cycle
Stage 2	变性	95℃	15 sec	30-35 cycles
	退火	55℃	15 sec
	延伸	72℃	30 sec/kb
Stage 3	彻底延伸	72℃	5 min	1 cycle

◆ 预变性温度推荐使用98℃，预变性时间推荐如下：简单模板（质粒等）设为30 sec；复杂模板（cDNA、基因组DNA等）设为3 min；高GC含量模板设为5-10 min。
◆ 退火温度需要根据引物值设置（值减去3-5℃即可），也可设立温度梯度去摸索引物退火的最适温度，如引物值≥72℃，可删除退火步骤，直接进行后续的延伸步骤(两步法PCR）。退火时间可在10-30 sec内调节。退火温度太低或退火时间太长都可能导致扩增特异性降低。
◆ 延伸温度推荐使用72℃。延伸时间推荐如下：简单模板（质粒等）15 sec/kb；复杂模板（cDNA、基因组DNA等）30 sec/kb；高GC含量模板可根据实际情况可延长至40 sec/kb。
◆ 扩增产物需放置于-20℃保存，防止该酶降解扩增产物。

产品组分

组分	21808（200 rxn）
○ 2 × MegaPfu Premix	5 × 1 mL

保存条件

-20℃储存，≤ 0℃运输。

常见问题解答

Q1: 无产物或产物量少

A1:
1.1引物：优化引物设计。
1.2退火温度：设置退火温度梯度，找到合适的退火温度。
1.3引物浓度：适当提高引物浓度。
1.4延伸时间：适当增加延伸时间至10-15 sec/kb。
1.5循环数：增加循环数至36-40个循环。
1.6模板纯度：使用高纯度模板。
1.7模板使用量：使用量参照反应体系推荐量调整并适当增加。

Q2: 有杂带或弥散条带

A2:
2.1 引物：优化引物设计。
2.2退火温度：尝试提高退火温度并设置退火温度梯度。
2.3引物浓度：适当降低引物浓度。
2.4循环数：减少循环数至25-30个循环。
2.5反应程序：使用两步法或Touch down PCR程序。
2.6模板纯度：使用高纯度模板。
2.7模板使用量：使用量参照反应体系推荐量调整并适当减少。

Q3: 样本量少

A3:
3.1直接PCR：简化实验流程，减少动手操作的时间，同时可以避免纯化过程中DNA的损失。
3.2梯度PCR：找到最优退火温度。

Q4: 特异性扩增

A4:
4.1降落PCR：与温度梯度PCR相比，降落PCR更有优势，降落PCR只需一次就可以获得很好的扩增效果，避免了对每对引物进行最佳复性温度的优化和测定工作，并且降落PCR在很大程度上减弱了仪器性能对扩增效果的制约。
4.2巢式PCR:巢式PCR是一种变异的聚合酶链式反应(PCR)，采用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通 PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，特异性的扩增位于首轮PCR产物内的DNA片段。如果第一次扩增产生了错误的片断，那么第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率会极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。