21411 2 × FastTaq Premix (with dye)
产品概述
■ 产品描述
2 × FastTaq Premix (with dye)是一种包含PCR反应所需FastTaq DNA聚合酶、buffer、dNTP Mixture以及稳定剂等组分的预混液。使用时，只需在本产品中加入模板和引物即可进行PCR反应，大大简化了操作过程，降低了PCR操作过程中污染的风险。针对片段长度不超过1.5 kb的目标PCR产物，本产品支持1 sec超快PCR延伸程序 (72℃延伸程序仅需设置为1 sec)。
■ 产品组分
| 组分 | 21411-01 | 21411-02 | 21411-03 |
| 2 × FastTaq Premix (with dye) | 5 × 1 mL | 2 × 21411-01 | 10 × 21411-01 |
· 预混液置于-20℃保存，避免反复冻融。
· 组分中已包含染料，扩增产物可直接用于电泳检测。
■ 保存条件
-20℃储存，≤ 0℃运输。
■ 实验流程
1.冰上配置反应体系
| 组分 | 体系 |
| Template DNA a | x μL |
| Primer 1 (10 µM) | 2 μL |
| Primer 2 (10 µM) | 2 μL |
| 2 × FastTaq Premix (with dye) | 25 μL |
| ddH2O | Up to 50 μL |
· FastTaq DNA聚合酶在室温下也有一定的反应活性，在冰上配制可以减少准备过程中发生的非特异扩增，提高反应的特异性。
a.针对不同来源或类型的模板，所需的反应浓度不同，下表为50 µL反应体系推荐模板使用量：
| 模板类型 | 推荐模板用量 |
| 动植物基因组DNA | 0.1~1 μg |
| 大肠杆菌基因组DNA | 10~100 ng |
| 质粒DNA | 0.1~10 ng |
| λDNA | 0.5~10 ng |
| cDNA | 1~5 μL(加入体积不宜超过反应总体积的1/10) |
2.反应程序
|
Stage |
程序 |
温度 |
模板起始量 |
循环数 |
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Stage 1 |
预变性 | 95℃ | 5 min | 1 cycle |
|
Stage 2 |
循环反应 | 95℃ | 30 sec | 30-35 cycles |
| 56℃ | 30 sec | |||
| 72℃ | 30 sec/kb或1 sec（1 sec延伸仅适用于≤1.5 kb的目标片段） | |||
|
Stage 3 |
彻底延伸 | 72℃ | 5 min | 1 cycle |
· 退火温度需根据引物和模板实际的GC含量调整
■ 引物设计
2. 引物的 GC 含量控制在 40%-60%之间，Tm 值调整至 55~65℃为佳，若模板本身 GC 含量过高或过低，30%-80%也可。
3. 上下游引物 GC 含量不宜相差过大，Tm 值相差不超过 1℃为佳，引物与模板非配对序列，不应参与引物 Tm 值计算。
4. 引物中四种碱基（A、G、C、T）随机分布，可降低引物与模板相似性，避免出现聚嘌呤或聚嘧啶。
5. 引物自身及引物之间不应存在连续的互补序列（5 个碱基），引物 3'端避免出现发夹结构。
6. 引物设计好后，可对其进行 blast 检测确定是否有非特异性扩增，NCBI 或 SnapGene 等可实现该功能。
7. 各种模板的引物设计难度不一，对于模板本身比较困难的（如 GC 含量或 AT 含量过高），引物设计应退而求其次，尽量满足以上条件即可。
常见问题解答
参考文献
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