Tolobio小编：首先，祝贺上海吐露港生物和中科院植生所合作，在Nature子刊Cell Discovery上发表了题为“CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection”（基于CRISPR-Cas12a的核酸探测）的文章。该方法有望在病原体检测、遗传病检测、癌症风险检测、环境检测、刑侦等众多跟核酸检测有关的领域大放异彩。

去年，CRISPR男神张锋团队发表了核酸检测的新方法，称为夏洛克（SHERLOCK，Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing），该方法是基于Cas13a蛋白具有RNA引导的特异性RNA识别，并对旁路RNA具有切割活性。就在上个月，王金团队发现了Cas12a具有RNA引导的DNA特异性识别，并对旁路单链DNA具有切割活性（原文链接：https://www.nature.com/articles/s41422-018-0022-x；故意不说Doudna的文章）。紧接着，这篇文章随即开发了新的检测方法，福尔摩斯（HOLMES, an one-HOur Low-cost Multipurpose highly Efficient System）。夏洛克和福尔摩斯都是基于CRISPR蛋白的核酸检测方法。区别在于夏洛克用了标记的RNA探针，识别RNA靶标，而福尔摩斯是标记的DNA探针，识别DNA，也因此在操作上福尔摩斯可能更方便稳定。小编也会在以后几期详解核酸检测方法，敬请关注。

 

 

 

01背景

如今，在人类基因分型和病原体检测等领域，对快速和低成本的核酸检测方法的需求仍在增长。虽然已有许多方法用于快速核酸检测，但是，这些方法可能无法同时满足特异性、灵敏度、快速、低成本和简单性的要求。 最近，基于RNA引导的和RNA靶向的CRISPR效应物Cas13a的旁路切割效应，建立了非常有潜力的基于CRISPR的诊断方法（CRISPR-Dx）（即SHERLOCK）。 SHERLOCK灵敏度高，特异性强，检测目标RNA非常方便。 但是，为了检测DNA序列，必须在SHERLOCK测试之前进行DNA到RNA的体外转录，这可能造成了操作上的不方便。

 

 

图： SHERLOCK原理示意图。

 

 

02结果

HOLMES方法正如它的名字一样，是核酸探测界的福尔摩斯，英文全名是“一小时、低成本、多目的、高效系统”（one-HOur Low-cost Multipurpose highly Efficient System）。

该方法分为两步，第一步是大量扩增，即通过PCR的方法大量扩增得到含靶标序列的小片段（150bp左右），与此同时，引入PAM序列（TTTN）。第二步是Cas12a的检测反应，直接将PCR扩增后的产物加入Cas12a反应体系中（包括crRNA，Cas12a蛋白，ssDNA探针），一旦Cas12a和crRNA识别靶标序列之后，即切割体系中的ssDNA探针（探针一端标记HEX荧光基团，一端标记BHQ1淬灭基团，仅当探针断裂后才会发出荧光），此时体系中发出荧光，从而确认靶标序列的存在。

结合PCR扩增之后的灵敏度是10 aM左右，也就是几十个分子的DNA即可被检测到。

图：HOLMES原理示意图，不同Cas12a的信号强度以及HOLMES的灵敏度。

 

SNP检测

同样的，HOLMES可以检测单个碱基的区别。通过合理设计crRNA，完全匹配的靶标序列才会发出荧光，而只要有一个碱基的不匹配，体系就不会发出荧光或者荧光很弱，从而区分单个碱基的区别。由此，该方法可以很容易地检测SNP（单核苷酸多态性）。

 

图：SNP检测。

 

 

DNA和RNA病毒检测
理所当然的，DNA和RNA病毒同样可以快速检测（当然RNA的检测需要有一步反转录的过程）。

 

 

图：RNA病毒检测流程示意图。

 

 

03总结与展望

尽管HOLMES和SHERLOCK都显示出了分子级别的检测灵敏度，可用于检测DNA和RNA，但本研究表明HOLMES可能在DNA检测方面更具有优势。
另外，等温扩增方法的方法（例如，重组酶聚合酶扩增（RPA）和环介导的等温扩增（LAMP））也可以作为前期扩增用于HOLMES，尽管本文中使用了快速PCR扩增。 类似于SHERLOCK，HOLMES也不需要昂贵的试剂和特殊的仪器，因此成本低，易于检测。 除了医疗应用如上所述，HOLMES也可用于多种用途，包括任何需要快速检测核酸的应用，比如监测食物和环境。

 

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41421-018-0028-z