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王金/赵国屏团队持续发力，开发新系统CRISPR/ dCas9-R2，通过阻断靶基因座中的DNMT1活性来降低DNA甲基化水平

2023-02-14

iNature

DNA甲基化和去甲基化在调节基因表达以及发育和病理过程中发挥关键作用。例如，启动子区域中的超甲基化通常抑制基因的转录，并且已经证明异常DNA甲基化与某些肿瘤相关。到目前为止，已经证明许多酶参与DNA甲基化或去甲基化，包括DNA甲基转移酶，其使用S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体来催化甲基转移至靶DNA。在哺乳动物细胞中，已经表征了三种活性DNA甲基转移酶，包括DNMT1，DNMT3A和DNMT3B。DNMT1是最丰富的甲基转移酶，在半甲基化的CpG二核苷酸中主要甲基化胞嘧啶，并负责维持DNA甲基化，确保复制过程中遗传的表观遗传模式的保真度。为了在体内进行基因座特异性去甲基化修饰，锌指（ZFs）和转录激活因子样效应物（TALE）已被用于融合易位甲基胞嘧啶双加氧酶1（TET1）催化结构域用于DNA去甲基化。然而，特定基因座结合所需的ZF（或TALE）的设计和蛋白质工程都是耗时且昂贵的，因此它们的应用受到限制。

2019年4月16日，上海师范大学的王金、中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所赵国屏团队等人在Cell Discovery上发表题为“ReprogrammableCRISPR/dCas9-based recruitment of DNMT1 for site-specific DNA demethylation andgene regulation”的文章，开发了一种新的基于CRISPR/ dCas9的系统（CRISPR/ dCas9-R2），通过阻断靶基因座中的DNMT1活性来降低DNA甲基化水平。

与此同时，iNature还发现，2019年3月12日，中国科学院上海生命科学研究院赵国屏、王金研究课题组在Cell Discovery上在线发表了题为“CRISPR/ddCas12a-basedprogrammable and accurate gene regulation”的最近研究成果；2018年3月12日，中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所王金在Cell Reserach在线发表题为“CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA”的文章，该文章发现ssDNA切割活性，包括顺式和反式切割，在Cas12蛋白中是普遍存在的。该研究发现可能将会用于潜在的生物编辑技术中，生物技术领域可能将迎来重大技术革新。

1、高效、可控、灵活!上海生科院赵国屏/王金改造新型CRISPRi系统

该研究通过突变天然crRNA的DR 基序来影响其介导的CRISPRi系统对靶基因转录抑制效率，通过选择不同DR基序，进而实现对靶基因进行不同效率的转录抑制，建立对靶基因精准调控的CRISPRi方法。文章利用gfp荧光报告系统和流式分选技术，建立不同DR基序的crRNA与其介导的基因转录抑制强度的对应关系。

文章还将筛选的介导不同转录抑制效率的crRNA DR数据库应用于DsRed基因和内源性基因，论证了精准调控CRISPRi方法同样适应于其他的基因。此外，文章还利用RNA凝胶迁移实验明确不同DR基序的crRNA与ddAsCas12a、靶DNA的亲和力关系，阐明不同DR基序影响CRISPRi转录抑制效率的分子基础。

CRISPR/ddCas12a系统对基因转录的精确调控

本文所建立的精准的CRISPRi方法有望应用于工业微生物的工程改造中，通过精准调控生物合成通路中关键基因的表达丰度，以减少宿主菌的代谢负荷，探索增加目标产物产量的潜在方案。此外，将大肠杆菌的实验结果和体外实验数据应用到人源细胞中，拟在哺乳动物细胞内建立精确的CRISPRi方法，可以进一步的促进我们对细胞生物学的研究。

2、上海生科院发现CRISPR-Cas12新活性，基因编辑又上升一个新高度

CRISPR相关蛋白Cas12a（以前称为Cpf1）是VA CRISPR系统的核酸内切酶，已应用于体内基因组编辑和体外DNA装配。Cas12a由单个CRISPR RNA（crRNA）具有丰富的T-protospacer相邻基序（PAM）序列切割双链DNA（dsDNA）的目标的指导下，产生粘性末端。从Cas9，Cas12a切割不同无论在RuvC催化口袋靶向dsDNA的靶和非靶链通过单活性位点。此外，Cas12a也处理前体crRNAs以产生成熟的crRNA。然而，Cas12a对单链DNA（ssDNA）靶标的切割活性不太清楚。

测定Cas12a / crRNA /靶DNA复合物的ssDNA切割活性

文章研究表明ssDNA的切割活性，包括顺式和反式切割，在Cas12a蛋白中都是普遍存在的。值得注意的是，Cas12a是迄今为止第一个特征性Cas蛋白，其三元复合物具有反式-ssDNA切割活性。考虑到环境中存在大量单链病毒，Cas12a可能在进化过程中发挥ssDNA切割活性，可能成为防止外源ssDNAs入侵的有力工具。

除了Cas12a之外，还发现了来自2型VI型CRISPR系统的RNA引导的和RNA靶向的CRISPR效应子Cas13a（以前称为C2c2），其具有对RNA 的反式切割活性。最近，Cas13a的这一特性已成功用于快速且灵敏的核酸检测。因此，研究中表征的Cas12a的切割活性也可以以类似的方式用于潜在的生物技术应用中。由于不同的Cas12a复合物在dsDNA上显示出不同的反式切割活性，因此深入的机制需要进一步研究。

3、深圳大学第一附属医院王金/中科院植物生理生态所赵国屏团队等开发新CRISPR / dCas9的系统（CRISPR / dCas9-R2）

随着CRISPR（聚集的规则间隔短回文重复）技术的改进，催化dCas9与TET1（TET1CD）的催化结构域融合以羟基化特定基因座并激活位点特异性去甲基化。虽然这种CRISPR系统带来了很多便利，但它需要表达外源TET1酶，因此可能对细胞代谢产生意想不到的影响。为了最大限度地减少外来成分的引入，研究人员开发了一种新的基于CRISPR/ dCas9的系统（CRISPR/ dCas9-R2），通过阻断靶基因座中的DNMT1活性来降低DNA甲基化水平。具体地，将具有茎 - 环结构的短RNA序列（命名为R2-茎环）引入单引导RNA（sgRNA）支架的四环和茎环2的两个位置。然后，DNMT1被R2-茎环特异性募集，其酶活性在与R2-茎环结构结合后被抑制，因此靶DNA基因座的甲基化被阻断。

基于DNA 甲基化的CRISPR/dCas9-R2系统

在该研究中，研究人员描述了一种可编程方法，用于方便活细胞中靶DNA序列的去甲基化。考虑到识别不同PAM位点的多个Cas9突变体的可用性，使用dCas9或其他dCas9突变体的CRISPR/ dCas9-R2系统可能具有靶向任何DNA序列的潜力。与目前可用于靶向DNA去甲基化的基于CRISPR的方法相比，结果显示出与CRISPR/ dCas9-TET1系统类似的编辑效率，但不需要共转染其他表观遗传酶，因此最小化对细胞代谢的意外影响。此外，CRISPR/ dCas9-R2系统的编辑窗口在目标位点附近距离约为100bp，并且可能比目前的CRISPR/ dCas9-TET1系统，在距离目标位点100-300bp的区域内有效。此外，与系统构造中具有挑战性的其他方法（如ZFs4和TALEs5）相比，CRISPR/ dCas9-R2系统的优势也得到了总结。