摘要

 

可程序化控制空间基因组组织是研究核结构如何影响基因调控和细胞功能的有力方法。在这里，我们开发了一个多功能的CRISPR-基因组组织（CRISPR-genome organization ；CRISPR-GO）系统，可以有效控制基因组位点相对于特定核区室的空间定位，包括核周边，Cajal体和早幼粒细胞白血病（PML）体。 CRISPR-GO具有化学诱导性和可逆性，可以检测染色质与活细胞核区室相互作用的实时动态。将基因组基因座诱导重新定位到核周边可以了解有丝分裂依赖性和非依赖性重定位事件，并且还用于了解基因位置和基因表达之间的关系。 CRISPR-GO在所需的染色质基因座上介导Cajal体的快速从头形成，并导致长距离（30-600kb）内源基因表达的显著抑制。CRISPR-GO系统提供可程序化平台，用于研究大规模空间基因组组织和功能。

 

图片由maple绘制

 

亮点：

CRISPR-GO是用于将基因组基因座靶向核区室的通用系统

研究空间基因组组织的可诱导和可逆方法

CRISPR-GO介导快速和可逆的Cajal体（CB）从头形成

CB-染色质共定位抑制远端（30-600kb）基因表达

 

原文：Wang H, Xu X, Nguyen C M, et al. CRISPR-Mediated Programmable 3D Genome Positioning and Nuclear Organization[J]. Cell, 2018.

 

细胞核内基因组的三维（3D）组织在调节发育期间和疾病中的基因表达和细胞功能中起着重要作用。例如，定位于核周边的基因表现出低转录，而定位于核内部的基因通常具有较高的活性。在淋巴细胞发育期间，祖细胞核周边的免疫球蛋白基因座重新定位到pro-B细胞的核内部，这一过程与免疫球蛋白激活和重排同步。类似地，胚胎干细胞核周边的转录因子Ascl1 / Mash1的基因位点重新定位到分化的神经元核内部。

 

无膜核体对于正确的基因组组织和细胞功能非常重要。例如，与小核RNA（snRNA）生物发生，核糖核蛋白装配和端粒酶生物发生有关的Cajal体（CB）对于脊椎动物胚胎发生是必需的，并且在肿瘤细胞和神经元中也是丰富的。早幼粒细胞白血病（PML）核体也与肿瘤发生和抗病毒感染有关。然而，核体/染色质共定位与基因表达之间的关系仍然知之甚少。

 

我们研究三维基因组结构与基因表达之间因果关系的能力受到现有方法的限制。显微成像（例如，荧光原位杂交，FISH）和基于染色体构象捕获（3C）的技术在发育和疾病过程期间具有染色质定位和相互作用的轮廓变化，提供有价值的相关信息。然而，它们通常不能在基因组组织和功能之间建立因果关系。

 

 

基于LacI-LacO相互作用的方法已被用于介导靶向基因组重组。该技术利用插入基因组基因座的LacO重复阵列，其使用与核膜蛋白融合的LacI募集到核周边。使用这种技术，将基因重新定位到核周边会导致基因抑制。然而，对于这种方法，创建稳定的含LacO重复序列的细胞系是先决条件，其涉及多个步骤，包括将大的LacO重复阵列随机插入基因组中，筛选含有单个插入基因座的稳定细胞系，以及表征基因组插入位点。需要新的工具来控制空间基因组组织。

 

原核II类CRISPR-Cas系统已被用于基因编辑、基因调控、表观基因组编辑、染色质环化和活细胞基因组成像的工具箱。与转录效应子偶联的核酸酶失活的Cas（dCas）蛋白可以调节与单引导RNA（sgRNA）靶位点相邻的基因表达。尚不清楚CRISPR-Cas系统是否可用于介导空间基因组组织和操纵与核区室的基因组相互作用。

 

我们开发了一种用于可程序化控制的3D基因组组织的通用系统，命名为CRISPR-基因组组织器（CRISPR-GO），通过配体介导的二聚化将CRISPR-dCas9系统与核区特异性蛋白偶联（图1A）。我们发现CRISPR-GO可以使特异性基因组位点有效地诱导和动态重新定位到核周边、Cajal体和PML体。可以对CRISPR-GO进行程序化以灵活地靶向不同的基因组序列。通过将CRISPR-GO与活细胞CRISPR-Cas9成像相结合，我们能够查看到染色质与核区室相互作用的实时动态。靶向核周边或Cajal体的基因组位点抑制近端报告基因表达。重要的是，基因组基因座与Cajal体的共定位抑制了远端（30-600kb）内源基因表达。CRISPR-GO系统提供了一种有用的技术来研究宏观（〜μm）空间基因组组织和细胞功能之间的关系，这与以前用于基因编辑和局部基因调控的用途不同。

 

图1.可程序化CRISPR-GO系统有效地将内源基因组基因座重新定位到核周边区域。（A）用于将基因组基因座靶向各种核区室的可编程和诱导型CRISPR-GO系统的示意图。（B）脱落酸（ABA）诱导的CRISPR-GO系统的示意图，其通过ABI-dCas9和PYL1-GFP-Emerin的共表达将靶基因组基因座靶向核周边。 NE：核包膜。

 

 

图3. CRISPR-GO能够使靶向染色质基因座与核体共定位，包括Cajal体和PML体。（A）ABA诱导型CRISPR-GO系统的示意图，用于通过共表达ABI-dCas9和PYL1-GFP- Coilin将基因组基因座靶向CB。（B）代表性的显微图像显示在-/ + ABA条件下靶向的LacO基因座（红色，通过FISH）和Coilin-GFP标记的CB（绿色）的共定位。（C）LacO基因座的CRISPR-GO CB束缚效率的定量。（D）使用CRISPR-GO系统将其他CB组分（绿色，SMN，Fibrillarin，Gemin2，通过免疫染色）与LacO基因座（红色，通过FISH）共定位目标LacO基因座到CBs。（E）代表性显微图像显示靶向Chr3基因座（红色，通过CRISPR-Cas9成像）和Coilin-GFP标记的CB（绿色）在-/ +中的共定位ABA条件。（F）Chr3基因座的CRISPR-GO CB-束缚效率的定量。（G）ABA诱导型CRISPR-GO系统的示意图，用于通过共表达ABI-dCas9和PYL1-GFP-PML将基因组基因座靶向PML体。（H）代表性显微图像显示靶向Chr3基因座（红色，通过CRISPR-Cas9成像）和PML-GFP标记的PML基体（绿色）的共定位-/ + ABA条件。（I）对靶向Chr3基因座的CRISPR-GO PML体系束缚效率的定量。对于C，F＆I，红色：与之共定位的目标基因座的百分比CB（C＆F）或PML体（I）n =分析的总位点;蓝色：含有至少一个CB共定位（C＆F）或PML身体共定位（I）基因座的细胞百分比，N =分析的总细胞数。 ***表示p <0.001，****表示p <0.0001。数据表示为平均值±SEM。（J）使用CRISPR-GO将Chr3基因座靶向PML体后，将另一种PML体标记物SP100（绿色，免疫染色）与Chr3基因座（红色）共定位在+ ABA条件下。比例尺，10mm。

 

 

图5. CRISPR-GO介导的染色质重新定位导致基因表达变化，可用于研究端粒生物学。（A和B）将靶向染色质DNA重新定位到核周边（A）或Cajal体（B）抑制相邻的报告基因表达。左图：CRISPR-GO系统的示意图，用于重新定位LacO重复阵列，其插入到驱动CFP-SKL报道基因的Dox诱导型TRE启动子附近。右：使用CRISPR-GO将LacO基因座重新定位于±Dox和±ABA条件下的核周边（A）或Cajal体（B）的CFP报告基因表达水平的比较。 （C）Cajal体共定位抑制长距离内源基因表达。左图：CRISPR-GO系统的示意图，用于将Chr3q29基因座共定位于CB。 ACAP2位于sgRNA靶位点上游35kb，PPP1R2位于下游36kb，TFRC位于575kb下游。右：通过qRT-PCR使用CRISPR-GO测量基因表达，以在±ABA条件下将Chr3基因座共定位于CB。（D）在±ABA条件下的示例细胞中间期期间端粒与最近核包膜点之间的距离的直方图。（E）使用CRISPR-GO系统将端粒重新定位至核膜的细胞活力的比较。对于（A） - （C）和（E），数据表示为平均值±SD。

 

 

图6. CRISPR-GO系统实现3D基因组组织的可程序化控制并扩展用于基因组工程的CRISPR-Cas应用。CRISPR-GO方法可以对微米级的3D基因组组织进行可程序化控制，从而扩展了CRISPR-Cas工具箱的实用性。