科技前沿综述：基因组编辑领域CRISPR-Cpf1（Cas12a）的大突破
The Conspicuity of CRISPR-Cpf1 
System as a Significant Breakthrough in Genome Editing

 

 

 

本周讲的一篇内容是关于CRISPR研究领域的综述。这篇文章跟小编的博士毕业论文密切相关，有问题可备注留言，留言必回。
先吐槽一下，Cpf1已经更名为Cas12a，但忠于原文，这里还是按Cpf1表述。

 

 

摘要
有规律的成簇间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR）-CRISPR相关蛋白（Cas）是一种微生物获得性免疫系统。 CRISPR-Cas系统分为两大类，六型。 Cpf1（Cas12a）属于V型（II类）CRISPR系统，它通过多种不同于Cas9的特征，差异化了基因组编辑方法，例如使用富含T的PAM（protospacer-adjacent motif）基序，不需tracrRNA的引导RNA，切割产生粘性末端，另外除了DNA核酸酶活性之外，还具有RNA加工活性。在这篇综述中，突出CRISPR-Cpf1（CRISPR-Cas12a）系统的最新进展，特别是考虑到对该系统的性质和生物学的考察，新的Cpf1变体拓宽了多功能性和可行性CRISPR-Cpf1系统，最后总结了CRISPR-Cpf1系统对原核，哺乳动物和植物模型基因组操纵的重要影响。利用CRISPR-Cpf1系统进行各种生物体基因组编辑的最新进展显示，该系统是一种可靠的基因组编辑方法分子工具箱。

 

 

背景

关于CRISPR背景就不介绍了，想了解的可以参看我写的本期CRISPR小知识。

 

Cpf1：CRISPR-Cas系统的新应用

 

CRISPR-Cpf1被归类为II类CRISPR系统的V型，并且在弗朗西斯菌U112（FnCpf1）Francisella novicida U112中被首次表征（2015年）（小编：目前NCBI上，该物种归为Francisella tularensis）。 FnCpf1是一个大蛋白，约1300个氨基酸，与Cas9基因座明显存在差异。Cpf1的CRISPR阵列包含九个间隔序列，它们通过重复序列[每个重复36个核苷酸（nt）]分开。通过比较16个Cpf1同源蛋白测试其在人细胞中的基因组编辑活性，结果显示来自FnCpf1、Moraxella bovoculi（Mb3Cpf1）、Lachnospiraceae bacterium（LbCpf1）和Acidaminococcus sp. BV3L6（AsCpf1）显示出了活力，为扩大基因组编辑工具箱的拓展带来了希望。所有Cpf1的PAM序列都被定为5'-TTTV-3'（V可以是C，G或A。CRISPR-Cpf1具有四个主要特征：（i）Cpf1具有RNase活性来处理其自己的CRISPR阵列（前体crRNA）；（ii）Cpf1相关的成熟crRNA不含tracrRNA，并且与CRISPR-Cas系统（类型I或III）类似，包括5'-位的重复序列和3'-位的间隔序列；（iii）Cpf1-crRNA复合物需要富含5'T的PAM来切割靶DNA；（iv）由Cpf1直向同源物在切割位点引入交错的双链断裂（5-或8个核苷酸与crRNA长度的5'-突出端）（小编：实际上，他的表述和图上切的位点有点含糊，精确切割位点可以我们的参考文章The CCTL (Cpf1-assisted Cutting and Taq DNA  ligase-assisted Ligation) method for efficient editing  of large DNA constructs in vitro）。

 

 

Cpf1是金属依赖性的并且以结构和序列特异性方式切割其RNA靶标。 Cpf1的核糖核酸酶活性通过加入Mg2 +而增加。另外，已经发现引入H843A，K852A，K869A和F873A等突变几乎可以阻断RNA的加工活性，但对FnCpf1的RNA结合活性无影响。此外，AsCpf1中保守残基（H800A，K809A，K860A，F864A和R790A）的突变也完全破坏了CRISPR阵列处理，但是不破坏DNA切割活性。

 

与SpCas9相比，Cpf1对靶位点内的错配更为敏感。已经阐明在切割位点的PAM近端位点（位置1-4）和PAM远端核苷酸处的8-nt对错配极其敏感。与SpCas9类似，Cpf1首先识别PAM，然后探索与目标DNA匹配的crRNA，但与SpCas9报道的DNA识别结构不同。目标位点周围的错配似乎干扰了Cpf1的结合，并因此削弱了DNA切割活性。与具有两个催化结构域（HNH和RuvC）的SpCas9相比（两个催化结构域切割互补和非互补DNA链），Cpf1的DNA切割活性由单个RuvC结构域介导。此外，Cpf1蛋白中现有的单一核酸内切酶结构域进一步被证明，表明在Mg2+或Ca2+存在下，互补和非互补DNA链上Cpf1的切割活性均无差异。

 

为扩大CRISPR-Cpf1系统作为多功能基因组编辑工具的用途，有必要解决其限制，即对富含T的PAM位点的改变。为了扩大Cpf1的靶向范围，AsCpf1和LbCpf1，它们经过结构诱变筛选。野生型AsCpf1识别靶区TTTV PAM位点，但通过突变，产生了识别TATV和TYCV（Y可以是C或T）的突变S542R / K548V / N552R（RVR变体）和S542R / K607R（RR变体） ，并且V被任意选择为C）的PAM，这些新的工程化变体分别在体外和体内保持其强烈的切割活性（RR〜70％和RVR〜78％）。使用BLISS评估RR和RVR的DNA靶向精确度，表明在不同靶区域这些变体具有高特异性。此外，为了提高Cpf1 PAM识别变体的特异性，将K949A突变（位于Cpf1蛋白的裂隙中以与非互补链相互作用）与RR和RVR变体组合，使得在所有靶标上修饰的减少并导致两种变体的更高特异性。最近，Yamano等在一个晶体结构研究中报道，Cpf1的PAM-结合通道，特别是LbCpf1，在识别经典（TTTV）和非经典（CTTV，TCTV，TTCV）PAMs中显示出构象灵活性。

 

对crRNA或Cpf1的mRNA的化学修饰对改善基因组编辑活性具有重大影响。已证明，化学修饰的crRNA在3'末端具有2'-氟核糖（cr3'5F），相对于野生型crRNA将靶切割效率增加了127％。 此外，化学修饰的AsCpf1（完全ψ-修饰）也使编码质粒的AsCpf1的基因切割效率最大化了177％。 令人惊讶的是，当ψ改变的AsCpf1或LbCpf1与cr3'5F相关时，在哺乳动物细胞中基因切割效率提高了300％。 根据这些结果，可以得出这样的结论：这种工程化策略对Cpf1的基因组编辑具有广泛的适用性。

 

CRISPR-Cpf1应用：

从细菌到哺乳动物

谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）是生产氨基酸和制造生物燃料和聚合物亚基的有价值表达系统。谷氨酸棒杆菌是一种高GC含量的生物，分为放线菌，其中利用CRISPR-Cas9产生工程表达系统会导致靶细胞的毒性。因此，使用识别富含AT的典型PAM位点的CRISPR-Cas系统似乎更有价值，因为可以使受体细胞的毒性降低。最近揭示FnCpf1可以用作谷氨酸棒状杆菌中有效的基因组编辑工具来引入插入片段，基因缺失和核苷酸突变。CRISPR-Cpf1与单链DNA（ssDNA）供体模板一起的效率为86-100％。

 

蓝细菌可以通过利用太阳能将二氧化碳转化为所需的最终产物，这使得它们成为生物制品生产的理想生物。然而，使用Cas9在每种缀合物中达到菌落，遇到了具有Cas9毒性的方案并遇到了毒性和低效率（<10个菌落）。通过利用对蓝细菌无毒的Cpf1，通过诱导无标记敲除（KO），敲入（KI）和点突变来改造三种蓝细菌（集胞藻属，鱼腥藻属和聚球藻属）。
CRISPR-Cpf1的效率在哺乳动物系统中也得到了很好的证实。 Kim等人检测了四种Cpf1直向同源物（LbCpf1，AsCpf1，FnCpf1和MbCpf1）的效率，阐明了LbCpf1和AsCpf1是真核细胞中最有效的内切核酸酶，尽管最近证明FnCpf1也可用于人类细胞。Cpf1的效率与黄色葡萄球菌Cas9（SaCas9）相似，分别为AsCpf1和LbCpf1的20±5％和19±6％，与SpCas9（32 ±4％）。

 

为了减少Cpf1的靶标效应，目前提出了两种方法：首先，转染Cpf1核糖核蛋白（RNP），因为蛋白质和RNA的半衰期比DNA短，利用Cpf1 RNP成功地消除了质粒被插入的担忧；其次，在3'区域使用截短的crRNA ，其使得在靶标位点处的插入缺失频率降低9倍，尽管使用截短的crRNA用于Cpf1的效率有限的。使用GUIDE-seq和深度测序分析证实，与高脱靶率的SpCas9相比，Cpf1在人类细胞中高度特异性。
Cpf1也显示了在体内研究的前景。将AsCpf1和LbCpf1的mRNA以及相应的crRNAs微注射到小鼠胚胎中靶向Trp53和Prkdc ，成体具有70-80％的突变频率，尽管估计在Prkdc基因座处AsCpf1导致的突变百分比为18.2％ 。此外，将AsCpf1 RNP电穿孔到小鼠的一个细胞胚胎中以靶向Foxn1基因座，导致64％成功突变，并且潜在脱靶基因座处没有可检测的到任何突变。基于这一成果，电穿孔是通过使用Cpf1 RNP创建小鼠模型的强大方法。

 

为了获得在人细胞的不同基因座处设计合适的gRNA，最近进行了评估在> 11,000个靶序列处的Cpf1 DNA切割活性。通过慢病毒载体将gRNA递送到人细胞中制备细胞文库。在通过质粒或慢病毒载体递送Cpf1之后，通过深度测序估计整合合成靶序列的插入缺失的频率。引入的高通量评估系统设计人细胞中各种靶位点的gRNA。表中列出了Cpf1 gRNA设计软件。除了SpCas9之外，Cpf1核酸内切酶作为有效的基因组编辑工具。Cpf1的核糖核酸酶活性使得可以从单一的预转录物处理几种成熟的crRNA，从而同时靶向几个基因组位点。而Cas9核酸酶需要大的构建体，或者递送多个表达质粒以能够进行多重基因组编辑。使用AsCpf1的RNA加工活性，用于多重基因组编辑的几种gRNA的递送将在哺乳动物细胞中被简化。此外，AsCpf1和LbCpf1的RNA加工活性也被证明可用于哺乳动物细胞中的多重基因组编辑。

 

 

CRISPR-Cpf1系统可以被设计成失活蛋白，但不失去靶向结合的活性，这样可用作细胞中的基因调控系统。通过在保守残基D880A（EeCpf1）中引入突变，提供了新的CRISPRi系统：DNA核酸酶失活的EeCpf1（EeddCpf1）。这种突变完全破坏了DNA切割活性，而不是EeCpf1的RNA加工活性，这提供了执行多重基因表达调控的机会。此外，已经发现EeddCpf1在靶向5'-UTR或编码区的互补链时具有广泛的基因抑制（86.7％）。这些发现引入了CRISPR-EeddCpf1系统作为基因表达调控工具箱。通过在其RuvC样结构域中引入E993A突变，也可以将AsCpf1转化为DNA核酸酶失活的AsCpf1（AsddCpf1），用作基因调控蛋白。

 

Cpf1在纠正人类细胞和小鼠模型中的基因突变方面是有效的。 AsCpf1和LbCpf1被成功用于纠正人类心肌细胞中的Duchene型肌营养不良症（DMD），方法是编辑无义突变或通过外显子跳跃重新构建突变缺失突变（out-of-frame deletion mutation）。通过向外显子51的剪接受体引入失活突变来实现重构策略，从而导致跳出缺失突变以恢复开放阅读框。此外，利用Cpf1直向同源物AsCpf1和LbCpf1，表明通过靶向肌营养不良蛋白基因的外显子23上的无义突变，随后通过HDR介导的修正修复靶位点，可以在mdx小鼠中进行DMD校正。

 

CRISPR-Cpf1作为细菌和哺乳动物细胞中开创性的基因组编辑工具，也在植物基因组工程中引发了一场革命。与哺乳动物细胞的研究成果一致，研究表明Cpf1直系同源基因没有显示出任何的靶标效应，尽管目标活性在植物细胞中并不是一个严重的问题。在表中总结了使用CRISPR-Cpf1在原核和真核生物基因组工程中的最新进展。

 

 

Cpf1 orthologs	Target gene	Indel frequency	Host	Delivery	Ref.
			Bacteria
FnCpf1	lacZ (leading strand)	64%	E. coli	Electroporation	[9]
	lacZ (lagging strand)	81%
	hmsT	83%	Y. pestis
	y4098	81%
	Ms1521	87.5%	M. smegmatis
			Yeast
FnCpf1	INT1	~85%	S. cerevisiae	LiAc/SS carrier   DNA/PEG method	[6]
LbCpf1	INT1	~85%
AsCpf1	INT1	20%
			Mammalian
AsCpf1	BRAF 1799T > A   mutation	65.8%	HEK293T cells	lentiviral   transduction	[10]
AsCpf1	BRAF 1799T > A   mutation	49.4%
AsCpf1	GFP	22%	293-SC1 cells	Transfection   Reagent (TurboFect)	[5]
LbCpf1	GFP	26%
FnCpf1	GFP	34%
			Plant
FnCpf1	NtPDS	~45%	Tobacco	Agrobacterium-mediated	[2]
	NtSTF1 (T)	71.4%
	OsDL	> 60%	Rice
	OsALS	> 60%
LbCpf1	OsEPFL9	7% a	Rice	Agrobacterium-mediated	[11]
FnCpf1	OsEPSPS	16.7%	Rice	Biolistic-mediated   transformation	[7]
	OsBEL	19.4%
	OsPDS	8.3%
LbCpf1	OsEPSPS	20.8%	Rice
	OsBEL	62.5%
	OsPDS	73.5%
FnCpf1 (Multiplex   gene editing)	OsRLK genes	43.8%-75%	Rice
LbCpf1 (Multiplex   gene editing)	OsBEL genes	40-60%	Rice
LbCpf1	OsPDS	21.4%	Rice	Agrobacterium-mediated	[8]
	OsBEL	41.2%
FnCpf1	OsCAO1	32%	Rice	Biolistic-mediated   transformation	[1]
LbCpf1	OsCAO1	10%	Rice
LbCpf1	FAD2-1A	0- 11.7%	soybean   protoplasts	Polyethylene   glycol-mediated RNP delivery	[3]
	FAD2-1B	0- 9.1%
AsCpf1	FAD2-1A	0.0- 1.6%	soybean   protoplasts
	FAD2-1B	0- 0.6%
LbCpf1	OsPDS, OsDEP1 and OsROC5	15- 25%	Rice protoplast	Polyethylene   glycol transformation	[4]
AsCpf1	OsPDS, OsDEP1 and OsROC5	0.6- 10%

 

 

总结

CRISPR-Cpf1系统作为基因组编辑工具是非常有前景的。在CRISPR-Cas9系统中crRNA的成熟需要Cas9蛋白，宿主RNA酶III和tracrRNA，而CRISPR-Cpf1系统似乎只需要Cpf1。Cpf1的RNA加工活性提供了在宿主细胞中使用多重基因组编辑的优点。根据这个特性，Cpf1最近已经在哺乳动物和植物细胞中报道了多重基因组编辑方法。此外，推荐将CRISPR-Cpf1系统的这一特性用于工业产品生产宿主（如谷氨酸棒状杆菌中的Cas9会导致致死性毒性）的多重编辑。 Cpf1同源蛋白的PAM识别特征限于富含T的规范形式5'-TTTN-3'或5'-TTN-3'，但是工程化的Cpf1变体（RR和RVR）带扩大通用性和适用性。此外，crRNA（cr3'5F）和Cpf1 mRNA（全ψ修饰）的化学修饰提高了哺乳动物细胞的基因组编辑效率。综合起来，工程化的CRISPR-Cpf1系统显着地最大化了基因组编辑效率，而不增加脱靶效应。 CRISPR-Cpf1介导的编辑可以作为治疗和遗传疾病相关的有效方法。此外，在以后的研究中Cpf1可以设计到以下问题：将ddCpf1蛋白与不同的功能域融合，包括用于高效基因表达调节的转录阻遏物或激活物结构域、用于分析染色质动力学的荧光蛋白、表观遗传修饰结构域，或者也可以开发DNA条形码跟踪细胞谱系的技术。

 

参考文献

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9. Yan MY, Yan HQ, Ren GX, Zhao JP, Guo XP, Sun YC (2017) CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria. Appl Environ Microbiol 83 (17). doi:10.1128/AEM.00947-17
10. Yang M, Wei H, Wang Y, Deng J, Tang Y, Zhou L, Guo G, Tong A (2017) Targeted Disruption of V600E-Mutant BRAF Gene by CRISPR-Cpf1. Mol Ther Nucleic Acids 8:450-458. doi:10.1016/j.omtn.2017.05.009
11. Yin X, Biswal AK, Dionora J, Perdigon KM, Balahadia CP, Mazumdar S, Chater C, Lin HC, Coe RA, Kretzschmar T, Gray JE, Quick PW, Bandyopadhyay A (2017) CRISPR-Cas9 and CRISPR-Cpf1 mediated targeting of a stomatal developmental gene EPFL9 in rice. Plant Cell Rep 36 (5):745-757. doi:10.1007/s00299-017-2118-z