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核酸分子检测方法小知识(下)

2023-02-14


小编:上期简单介绍了核酸分子的各种常见检测方法。本期,重点介绍和CRISPR相关的核酸检测方法。虽然同为CRISPR,但是各种CRISPR检测技术也有所不同,详见下文。、

 

快速核酸分子检测是公众健康、环境检测、刑侦等领域非常关键的技术。核酸分子检测,不仅可以用于检测人、动植物等是否感染了病原体,也可以检测如遗传病或癌症风险检测、个人用药提供辅助参考、水体是否有微生物污染等。目前,已经开发出了不少核酸检测方法,如Realtime PCR、FISH杂交技术(Fluorescence in situ hybridization)等。但是,仍需要开发兼有快速、廉价、灵敏的核酸检测技术。

 

近几年来,CRISPR技术在基因组编辑领域表现出了巨大的应用价值。完成这一任务的主要是Cas9等DNA(或RNA)靶向的核酸内切酶。人们只要通过简单的设计向导RNA,就可以将Cas9等蛋白靶向到任意含PAM(如Cas9的PAM序列为NGG)的核酸靶标序列,并引起双链DNA的断裂(或RNA的切割)。除了基因组编辑,CRISPR还可以用于基因调控、表观遗传学编辑、功能基因筛选、基因组成像等1。最近,CRISPR这个丰富的工具箱开始在核酸检测领域出现并受到关注2。

 

首先出现的CRISPR相关核酸检测技术是基于dCas9(dead Cas9)蛋白的技术。dCas9是将Cas9的两个催化切割活性位点突变,从而失去切割双链的活性,但dCas9仍然保留由向导RNA引导并结合特定DNA的能力。Chen等利用dCas9与EGFP荧光蛋白融合,可以利用特定向导RNA引导,通过显微镜可以观察到靶标序列处的荧光3。2017年,Guk等报导了基于dCas9/sgRNA-SG I的DNA-FISH系统,可以选择性的检测甲氧西林耐受的金黄色葡萄球菌4。

 

2013年,Collins团队建立了在纸片上即可检测寨卡(Zika)病毒的方法,也可以区别病毒株5。该方法涉及到RNA的提取、扩增和Toehold反应检测过程,通过设计,如果一种病毒株恰巧与另一株在PAM的位点序列处不同(即一种是NGG,另一种则不同),即可通过Cas9靶向切割含PAM的菌株,从而影响扩增过程和Toehold的检测5。最近,另一种基于Cas9的核酸检测方法的原理是CRISPR/Cas9触发的等温扩增方法,也可用于位点特异性核酸检测。这个技术涉及到CRISPR/Cas9的切割、切口酶和DNA聚合酶,这种方法不仅可以检测到 0.82 amol 的靶标浓度,而且可以区分核酸分子单个碱基的区别6。该方法的靶标区分相对前一种方法来说更加普遍适用。

另一种核酸检测的原理则是基于一些Cas蛋白具有的“反式切割”(或称“旁路切割”)效应。2016年,张锋等发现Cas13a(旧称C2c2)具有旁路切割活性, 即当Cas13a结合靶标RNA序列之后,会表现出杂乱切割其他RNA的特性7。通过设计,将Cas13a的旁路切割特性与等温扩增相结合,应用于特异性核酸检测,称之为SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)8。接着,张锋等又报导了改进版本SHERLOCKv2,实现单个反应四通道的检测9。与此同时,同样具有“反式切割”活性的Cas12a被发现,相比Cas13a靶向的是RNA序列,而Cas12a针对的是DNA序列10,11,因此在操作上可能更加方便。

 

 

 

 

虽然已有不少CRISPR相关的核酸检测方法,更快、更简便、更便宜的核酸检测新方法有待开发。

 

参考文献:

 

1             Wang, H., La Russa, M. & Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annu Rev Biochem 85, 227-264, doi:10.1146/annurev-biochem-060815-014607 (2016).
2             Uppada, V., Gokara, M. & Rasineni, G. K. Diagnosis and therapy with CRISPR advanced CRISPR based tools for point of care diagnostics and early therapies. Gene 656, 22-29, doi:10.1016/j.gene.2018.02.066 (2018).
3             Chen, B. et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell 155, 1479-1491, doi:10.1016/j.cell.2013.12.001 (2013).
4             Guk, K. et al. A facile, rapid and sensitive detection of MRSA using a CRISPR-mediated DNA FISH method, antibody-like dCas9/sgRNA complex. Biosensors & bioelectronics 95, 67-71, doi:10.1016/j.bios.2017.04.016 (2017).
5             Pardee, K. et al. Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell 165, 1255-1266, doi:10.1016/j.cell.2016.04.059 (2016).
6             Huang, M., Zhou, X., Wang, H. & Xing, D. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 Triggered Isothermal Amplification for Site-Specific Nucleic Acid Detection. Anal Chem 90, 2193-2200, doi:10.1021/acs.analchem.7b04542 (2018).
7             Abudayyeh, O. O. et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 353, aaf5573, doi:10.1126/science.aaf5573 (2016).
8             Gootenberg, J. S. et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, doi:10.1126/science.aam9321 (2017).
9             Gootenberg, J. S. et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science, doi:10.1126/science.aaq0179 (2018).
10           Li, S. Y. et al. CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA. Cell Res, doi:10.1038/s41422-018-0022-x (2018).
11           Chen, J. S. et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science, doi:10.1126/science.aar6245 (2018).