核酸分子，也就是DNA和RNA，作为最重要的生命基本物质，如何做到兼顾快速、高灵敏、高特异、廉价的检测，是重要议题。这里，小编总结了核酸分子检测方法的小知识。

 特异性检测核酸分子（Nucleic acid detection）方法具有重要的应用价值，例如病原体的检测，遗传病检测等。在病原体检测方面，由于每种病原体微生物都有其独一无二的特征核酸分子序列，因此可以开发出针对特定物种的核酸分子检测，也称为核酸诊断（NADs, nucleic acid diagnostics），在食品安全、环境微生物污染检测，人体病原菌感染等领域具有重要意义1,2。另一个方面是对人或其他物种的单核苷酸多态性（SNPs, single nucleotide polymorphisms）的检测。在基因组水平上去理解遗传变异和生物学功能之间的关系为现代分子生物学提供了新视角，而其中SNPs对生物学的功能、进化和疾病等密切相关，因此SNPs的检测与分析技术的发展尤为重要  3,4。

目前已建立了不少NADs的方法，主要是针对特异性DNA分子的检测，也有部分方法针对RNA分子。通常来说，DNA分子非常稳定，因此检测样品可来源于一系列复杂的生物样本；而RNA则非常容易降解，因此处理时需要非常小心。在上世纪70年代，建立了限制性内切酶酶切检测的方法，后来又发展了Southern、northern和斑点杂交等方法进行特异性检测核酸分子检测。1985年，当PCR方法成为常规实验方法后，导致了分子生物学指数级的进步。目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。PCR技术是最先建立也是目前最常用的扩增方法，目前在PCR方法基础上，引入了标记荧光探针，可以实时检测靶标的扩增情况，称为Realtime PCR。

Realtime PCR不仅是快速、高灵敏的检测方法，同时这种方法也可以进行定量分析。除了PCR的扩增方法，还建立了许多替代方法，比如ligase chain reaction, branched DNA amplification, NASBA, SDA, transcription-mediated amplification, loop mediated amplification, rolling circle amplification and TwistAmp™ 等。许多这些替代方法的优势在于等温性，也就是说只需要一个温度即可以完成反应，而不需要像PCR那样的热循环仪器。核酸检测的方法除了Realtime PCR可以直接完成扩增和检测之外，FISH杂交技术（Fluorescence in situ hybridization）是最常用的检测方法，通过标记分子探针，原位与互补的靶标序列杂交。除此之外，目前还开发了biosensors, nanopores 和next-generation sequencing technologies等检测方法，但这些方法通常需要昂贵的实验设备。

对SNPs的检测首先同样需要进行PCR等方法的扩增，从而获得足量的含SNP位点区域片段进行进一步的检测。比较常用的方法有：引物延伸（primer extension），杂交（hybridization），连接（ligation）和酶切（enzymatic cleavage）。当完成上述方法之后，需要进行特定的方法检测，比如质谱检测、荧光检测、化学发光检测等。

核酸检测虽然如上文所述已开发出了不少检测方法，但是在某些情况下，如何更加快速、简便、廉价的检测是重要的发展方向，比如在野外的病原菌快速检测、药物敏感SNP快速检测等。在2016年，Collins等基于CRISPR-Cas9特异性识别并切割靶标序列的特点，开发了快速廉价检测寨卡病毒（Zika）的方法5。2017年，张锋等利用CRISPR-Cas13a具有“旁路活性”（collateral effect）的特点建立了快速核酸探测的方法，即Cas13a结合特异性靶标RNA后随即切割其他RNA（这里设计成RNA荧光报告系统），与等温扩增技术recombinase polymerase amplification (RPA)相结合，把这种检测方法称为SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing) 6。上述方法涉及到RNA的检测，如果只需针对DNA的检测，鉴于RNA的不稳定性，可能会增加了操作难度。

 参考文献：

1       O'Connor, L. & Glynn, B. Recent advances in the development of nucleic acid diagnostics. Expert review of medical devices 7, 529-539, doi:10.1586/erd.10.22 (2010).
2       Scheler, O., Glynn, B. & Kurg, A. Nucleic acid detection technologies and marker molecules in bacterial diagnostics. Expert review of molecular diagnostics 14, 489-500, doi:10.1586/14737159.2014.908710 (2014).
3       Kim, S. & Misra, A. SNP genotyping: technologies and biomedical applications. Annual review of biomedical engineering 9, 289-320, doi:10.1146/annurev.bioeng.9.060906.152037 (2007).
4       Syvanen, A. C. Accessing genetic variation: genotyping single nucleotide polymorphisms. Nat Rev Genet 2, 930-942, doi:10.1038/35103535 (2001).
5       Pardee, K. et al. Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell 165, 1255-1266, doi:10.1016/j.cell.2016.04.059 (2016).
6       Gootenberg, J. S. et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, doi:10.1126/science.aam9321 (2017).
7       Zetsche, B. et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell 163, 759-771, doi:10.1016/j.cell.2015.09.038 (2015).