小编：前几期的CRISPR小知识介绍了CRISPR的基础知识，包括CRISPR的发现历史、免疫机理和分类，之后又介绍了CRISPR在基因组编辑、高通量功能筛选、基因表达调控和表观遗传学的编辑。那么CRISPR还能有什么应用呢？本期，我们介绍CRISPR用于体内特征DNA或RNA成像。

在后代基因组时代，科学家面临的另一个挑战是了解DNA线性遗传信息与细胞三维组织之间的相关性。许多研究表明，基因组结构的三维组织可能在调节基因表达和控制细胞分化中起重要作用1。进一步研究基因组结构，基因表达和细胞行为之间的相关性受到缺乏可视化活细胞中序列特异性基因组动力学的工具的阻碍。Cas9对基因组中特定序列的定位能力以及易于将其重定向到不同基因组位点的能力使其成为研究活细胞中基因组组织和动力学的有希望的候选者。

从原理上来看，通过核苷酸碱基配对相互作用或序列特异性蛋白质-DNA相互作用可以实现细胞核中特定基因组的标记。核酸相互作用的标记技术，如原位杂交（ISH）测定，已广泛用于基因组研究和遗传疾病的临床诊断。ISH将体外合成和标记的核苷酸探针用于互补的内源基因座2-4。虽然功能强大，但是这些ISH测定通常限于固定样品，并且DNA在标记的探针需结合之前变性。

ISH技术的替代方法是通过序列特异性蛋白质-DNA相互作用标记基因组基因座。使用荧光结合蛋白（FP）并在活细胞中表达这些构建体，易于进行活细胞成像。此外，一些DNA结合蛋白对活细胞中的同源DNA序列具有高结合特异性，并且这些蛋白质-DNA相互作用不需要DNA变性。可视化基因组的初步工作涉及到将Lac/Tet操纵子序列重复序列插入到特定的基因组位点。然后使它们的结合蛋白与FP融合5-7，将这些外源加入的重复序列可视化。这种方法使我们能够了解活细胞中基因组基因座的动力学。然而，将重复的串联重复序列插入到特定的基因组座中非常费力，并且该方法不能用于直接标记内源序列。因此，使用可编程DNA结合蛋白，如ZF，TALE和Cas9s，为成像这些基因座提供了强大的方法。

几个研究组已经使用ZFs或TALE对内源基因座进行成像。最初通过将绿色荧光蛋白（GFP）融合ZF蛋白，对活细胞中重复序列区域进行成像8。几项研究9-12也通过将FP融合到TALE中，对基因组重复序列进行成像。Miyanari等9报道了一种TALE介导的基因可视化方法，用于跟踪活体胚胎和小鼠胚胎中着丝粒和端粒的动力学，他们还使用这种方法有效地区分两种亲本染色体与不同的单核苷酸多态性，表明具有高特异性。Ma等10发表了类似和补充的结果，显示两个TALE标记的不同颜色可以同时动态跟踪活细胞中的中心体和端粒。他们还显示体外纯化的TALE蛋白可以通过使用比FISH简单的方案来标记固定细胞中的基因座位点。Thanisch等人的另一项工作11使用FP-TALE来跟踪mESCs整个细胞周期的卫星重复动态。

基于Cas9的成像方法将核苷酸相互作用和蛋白质-DNA相互作用的优点结合起来标记内源性基因座基因座。报道了TALE介导的基因组成像后不久，使用dCas9进行基因组成像的第一个工作发表了13。在这项工作中，Chen 等13将Sp dCas9融合到eGFP中动态呈现活细胞中编码和非编码序列的基因组基因座。在该研究中，使用单个sgRNA在整个细胞周期中动态追踪重复的基因组位点，非重复的基因组座位也可以通过共同递送多个基因座的sgRNA进行标记13。另一研究组使用类似的策略来标记活体mESCs中的内源着丝粒，重心区域和端粒14。目前又有几项改进和扩展基于Cas9的基因组成像的研究。Tanenbaum等人15将dCas9介导的基因组成像与SunTag肽阵列组合，以扩增由每个dCas9产生的荧光信号。另外，Ma等16使用用不同FP标记的正交dCas9开发了多色基因组成像。在这项工作中，Sp dCas9，Nm dCas9和St1 dCas9被单独标记为不同颜色的FP。不同的dCas9-FP融合物通过相应的sgRNA靶向不同的基因组位点。作者证实了活细胞中多个重复基因组基因座的同步跟踪动力学，两个正交的dCas9可以区分两个大约2个基因分开的两个基因座（72个）。因为三个dCas9s识别不同的sgRNA和PAM序列，所以该系统提供了一个跟踪多个基因座动力学的工具。

CASFISH的方法中，固定细胞和组织也可以通过体外组装荧光标记的dCas9-sgRNA复合物进行有效的标记17。与传统FISH相比，CASFISH可以使用dCas9介导的酶反应进行快速的序列特异性标记，因此可能有助于保持细胞和基因组结构。作者实现了单个sgRNA对重复序列进行成像，并使用一系列sgRNA对非重复序列进行成像。鉴于预先组装的Cas9-sgRNA复合物是稳定的，作者还成功使用针对不同颜色的不同基因座的单独预组装的Cas9-sgRNA复合物来显示多色成像。

这些可编程序列特异性DNA结合蛋白是用于监测活细胞基因组动力学的有力的工具。然而，特定基因组轨迹的可视化需要在附近区域招募多拷贝的标记蛋白质。站点特异性结合如何影响局部染色质结构和转录活性需要更多的研究。为了最小化局部染色质结构的扰动，今后的工作应该集中在减少引入给定基因座的Cas9-sgRNA复合物的数量。此外，这些技术需要进一步优化以有效地跟踪活细胞中任何非重复序列的动力学。然而，目前的dCas9系统需要至少26-36个sgRNA来有效地显现非重复序列的基因组位点13，这在设计，克隆和递送方面不是很容易，因此限制了dCas9成像在不同细胞中的应用类型和组织。

为了改善该系统，有必要减少所需数量的sgRNA并实现更灵敏的基因组标记。此外，需要更多的研究来评估dCas9介导的基因组基因座标记的特异性和稳定性。

如前文所述，dCas9靶向DNA特定基因座已有不少研究所证实，但大多数RNA靶向方法依赖于外源标签的并入。Doudna实验室证明SpCas9同样可以以核酸编程的方式结合RNA18，并允许活细胞中的内源性RNA跟踪19。Nelles等19显示核定位的RNA靶向Cas9（RCas9）仅在存在靶向mRNA的sgRNA的情况下输出到细胞质，并观察与荧光原位杂交相关的RNA颗粒中的ACTB，CCNA2和TFRC mRNA的积累。他们还展示了时间分辨的ACTB mRNA运输测量来应激颗粒。研究结果建立了RCas9作为手段，以可编程的方式跟踪活细胞中的RNA而无基因编码标签。

参考文献

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