CRISPR小知识：

CRISPR用于基因的表达调控

之前几期，小编介绍了CRISPR的基础小知识，还有CRISPR在基因组编辑和大规模功能性筛选的应用。本期，简单介绍下CRISPR应用的重要领域——基因表达调控。

将Cas9的切割的活性突变后，它可以被改造成能特异招募蛋白和RNA到特定的DNA位点的平台，并且进一步的开发出特异基因调控的强大工具，这种失去切割活性的Cas9被称为dCas9（dead Cas9）。为了实现基因调控，将转录的激活子或抑制子与dCas9融合，dCas9仍然能结合sgRNA并靶向靶标DNA（通常是目标基因的启动子附近），实现激活或抑制特定基因的目的1。

图：基于dCas9的序列特异性基因调控（图引自2）。
FIG Nuclease-deactivated Cas9 (dCas9)-mediated sequence-specific gene regulation.

在细菌细胞中（如大肠杆菌3,4和肺炎链球菌3中），仅dCas9就可以通过阻碍转录机器有效的抑制转录，这个技术称为CRISPR干扰（CRISPRi）。靶向靶基因的启动子元件或编码区的dCas9蛋白足以通过定位阻断RNA聚合酶II结合或抑制转录延伸来显着地抑制位点特异性的基因表达（图）。例如，dCas9和sgRNA或tracrRNA+工程化的crRNAs表达有效抑制了载体基因：当dCas9-sgRNA复合物靶向mRFP基因（基于红色荧光蛋白的报道系统）时，观察到300倍的抑制3；当GFP报告质粒的区域被靶向时，使用dCas9的抑制超过100倍的荧光减少。研究表明，将sgRNA靶向启动子的-10和-35区产生最强的基因抑制作用，不论靶向哪个靶标。当5'-UTR或编码区域被sgRNA靶向时，非模板链被靶向时，抑制的效果更强（称为冲突模型collision model）3。此外，靶向抑制被设置为可调节和可逆的，当将多个sgRNA靶向相同感兴趣的基因时，以叠加方式增加抑制。当将CRISPR/dCas9系统用于高通量筛选实验时，可以使用RNA测序确定任何脱靶效应。亓磊等考察了CRISPR/dCas9系统的特异性，发现只有靶基因受到影响，表明该系统高度精确3。除了dCas9介导的抑制之外，dCas9可以与激活子融合以诱导靶基因的转录。通过与RNA聚合酶ω亚基的N-和C-末端融合，将dCas9蛋白转化为转录激活因子。当靶向与-35启动子元件的最佳距离时，dCas9-ω融合蛋白诱导lacZ和GFP报告基因的表达。

通过CRISPR/dCas9系统调节基因表达在酵母和哺乳动物细胞中也是有效的。然而，由于哺乳动物体细胞的复杂性，其各种表观遗传修饰和关键的调节机制，该系统在哺乳动物细胞中相对来说效果较差1。具有募集转录因子能力的功能域与dCas9融合来调节转录，dCas9蛋白单独或融合转录抑制子有效抑制了酿酒酵母中的基因表达1。当dCas9单独和dCas9和Mxi1（哺乳动物转录抑制子结构域）的激活靶向于酿酒酵母中内源性TEF1基因座上表达的TEF1-GFP时，分别观察到18倍和53倍的抑制1。设计将dCas9蛋白与VP64结构域融合，可调节CYC1启动子控制下的GFP表达，根据dCas9在启动子中的位置，GFP表达被上调或下调5。Gilbert等1使用dCas9偶联转录激活物VP16和p65激活结构域（AD）来激活表达Gal4 UAS-GFP报告基因，该基因在胚胎肾细胞系（HEK293）中表达1。通过不同的融合蛋白，报告基因表达成功激活且具有不同水平的激活1。此外，dCas9与VP64转录的AD融合，在HEK293细胞系中增加了内源性人基因的转录6,7。这些实验证实了CRISPR/dCas9系统在哺乳动物细胞培养物中的有效性，并且该系统可以控制内源性过程，如细胞分化，影响人类干细胞的发育途径8。共表达多个sgRNA的dCas9的共表达使内源基因靶标能够协同激活，而没有检测到的脱靶效应6,7。

之后的一些研究专注于提高内源性基因表达的激活效率9-12。一种方法是，将多个激活子共同募集到预期的靶位点处10,12。在这种方法中，dCas9是作为一个支架，许多拷贝的串联肽（称为SunTag阵列）融合，以招募VP64效应物的多个拷贝。与dCas9-VP64对照相比，人细胞内源性蛋白质产生增强了50倍。另一种方法将单个dCas9融合多个激活子，如VP64，p65和Rta。与基于VP64的活化剂相比，这种新的dCas9嵌合体（命名为dCas9-VPR）将基因表达上调到300倍，并且在酿酒酵母，果蝇和小鼠和人类细胞系中成功使用9。

类似地，dCas9与KRAB，CS或WRPW等具有抑制染色质修饰功能的结构域融合，来增加转录抑制的功效。CRISPR/dCas9基因调控也用于植物中，比如烟草中瞬时表达的基因和内源基因的表达13,14。

上述实例中，效应结构域与dCas9的偶联产生了的转录激活或抑制的效果。然而，dCas9蛋白本身就大，加之功能域后的总体尺寸更大，这种融合蛋白质并不总是有效的。最近的研究关注蛋白的大小限制，例如，具有更小的尺寸dCas9蛋白，且不失活性15。此外，还开发了新的sgRNA支架，例如具有结合RNA的MS2结构，促进了转录激活因子的招募11,16。

基于dCas9的调控已经有了广泛的应用，然而，对于多个靶标，需要独立表达多个单向导RNA（sgRNA），不太方便。为了解决这个问题，张小春等采用了DNase-dead Cpf1突变体（ddCpf1）进行多重基因调控17。证明单独的ddCpf1可以用于大肠杆菌中的基因抑制，并且对于特异性靶向其靶基因的模板链的CRISPR RNA（crRNA）来说，抑制更有效，这与dCas9不同。当靶向启动子区时，两条链均显示出ddCpf1/crRNA复合物的有效抑制作用。进一步采用全转录组RNA-seq技术来证明ddCpf1介导的抑制的高特异性。此外，证实了ddCpf1中RNA酶活性能够处理前体CRISPR阵列，从而在体内简单生成多个成熟的crRNA，促进多重基因调控。通过采用这种多重基因调控策略，我们还展示了如何快速筛选候选靶标文库，比如大肠杆菌中的双组分系统。因此，CRISPR-ddCpf1系统可能进一步开发并广泛应用于生物研究和临床研究。

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