CRISPR小知识：CRISPR用于DNA片段拼接

小编：DNA片段拼接通常有两个方向的目标：1. 标准化。这是基于合成生物学的工程学思维，实现接口的通用性和方法标准化。2. 快速、简便、高效、大片段、多片段。

之前几期介绍了CRISPR的基础知识和应用，你是否能想到，CRISPR还可以应用于DNA片段的拼接？目前，利用CRISPR蛋白建立了不少DNA拼接的新方法，比如C-Brick标准化拼接、CCTL拼接、CATCH大片段抓取和CasHRA拼接等（小编参与了前2个方法的开发）。

片段切割与组装

1970年代，第一次将DNA片段通过限制性内切酶和连接酶实现了DNA序列的“切和连”，从而开启了基因工程的生物技术革命1,2。合成生物学延续了基于重组DNA的技术，同时又加入了新的要求和思想。从大方向来说，DNA组装技术追求两个大的方向，一个是建立组装的标准，实现其操作标准化3，另一个是建立更简便、高效、且能组装更大更复杂片段的方法4。BioBrick的标准是Tom Knight等人在2003年提出的，是最先建立的一套DNA体外拼接标准。该方法利用了一组标准化的限制性内切酶切位点，分别叫做前缀（含EcoRI、XbaI位点）和后缀（含SpeI、PstI位点）的序列位于每一个生物元件的两端。利用这些位点进行切割和后续的连接便形成了一个标准化的DNA拼接流程5。BioBrick标准目前仍然应用于合成生物学领域，特别在每年的国际遗传工程机器大赛（iGEM）大赛中，很多工作的实现都是利用BioBrick标准。BioBrick标准对合成生物学的主要贡献包括以下两点：首先，两端的内切酶序列为单个生物元件设立了物理边界，因此DNA的拼接可以像乐高玩具一样，便于将来工程化的操作；其次，在整个研究群体中，标准化拼接方法的建立可以实现不同研究团体间DNA元件的通用，避免了重新构建的麻烦，也实现了资源共享。尽管有这些优势，但是BioBrick最主要的局限是元件序列中不能含有前后缀中的酶切位点序列。另外，连接中会形成疤痕序列，这种疤痕序列可能会影响生物元件的功能，并且不能用此方法构建融合蛋白。

针对BioBrick标准的缺陷，陆续产生了不少改进的标准。比如BglBrick标准中利用BglII和BamHI作为同尾酶连接，从而使得连接之后得到的疤痕序列（编码甘氨酸-丝氨酸），且可以实现两个蛋白的融合表达6。另外，称为iBrick的标准，利用识别长序列的归位内切酶代替了常规的II型限制性内切酶，从而避免了BioBrick标准中对于DNA元件序列的要求（例如，不能含有标准中的酶切位点等）7。但iBrick也存在明显的缺点，即利用iBrick标准拼接的两个元件之间会形成一个较长的疤痕序列。最近，有研究利用CRISPR相关蛋白Cas12a开发了一套C-Brick的拼接标准。由于Cas12a可以由人工设计的crRNA特异性引导切割DNA并形成5’突出的粘性末端，通过类似BioBrick的前后缀设计思路，从而实现DNA元件的标准化拼接。C-Brick的优点是，不仅可以识别长的序列（26bp左右的特定序列），而且产生短的疤痕序列（编码的氨基酸与BglBrick相同）8。

对于大片段DNA，体外的获取、编辑等操作有一定难度，有不少利用Cas蛋白操作的新技术。比如，朱听研究组基于Cas9开发了CATCH（Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments）技术，结合Cas9切割以及Gibson连接，实现了大片段基因簇的获取9。类似地，孙宇辉等也开发了基于Cas9的体外编辑技术10。最近，Cas12a又拓展应用到体外大的DNA构建物的有效编辑，称为CCTL (Cpf1-assisted Cutting and Taq DNA ligase-assisted Ligation)方法，该方法利用任意设计的crRNA（用缩短的crRNA以增加切割位点的专一性）可以切割特定位点的DNA并形成粘性末端，然后用同样末端的片段来代替需要编辑的位置11。又比如，多个超大DNA片段同时转化到酵母体内有一定的技术难度；覃重军团队开发了CasHRA技术，利用酵母原生质体融合，结合Cas9在体内切割释放出待拼接的DNA片段，然后利用酵母体内重组系统将片段拼接，最后得到1.03 Mb的MGE-syn1.0最小大肠杆菌基因组12。

参考文献

1 Cohen, S. N., Chang, A. C., Boyer, H. W. & Helling, R. B. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 70, 3240-3244 (1973).
2 Lobban, P. E. & Kaiser, A. D. Engineering a Reduced Escherichia coli Genome. J Mol Biol 78, 453-471 (1973).
3 Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S. & Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol 16, 568-576, doi:10.1038/nrm4014 (2015).
4 Ellis, T., Adie, T. & Baldwin, G. S. DNA assembly for synthetic biology: from parts to pathways and beyond. Integr Biol (Camb) 3, 109-118, doi:10.1039/c0ib00070a (2011).
5 Knight, T. Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. 1-11, doi:http//hdl. handle. net/1721.1/21168 (2003).
6 Anderson, J. C. et al. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng 4, 1, doi:10.1186/1754-1611-4-1 (2010).
7 Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P. & Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One 9, e110852, doi:10.1371/journal.pone.0110852 (2014).
8 Li, S. Y., Zhao, G. P. & Wang, J. C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1. ACS Synth Biol, doi:10.1021/acssynbio.6b00114 (2016).
9 Jiang, W. et al. Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments CATCH enables one-step targeted cloning of large gene clusters. Nat Commun 6, 8101, doi:10.1038/ncomms9101 (2015).
10 Liu, Y. et al. In Vitro CRISPR/Cas9 System for Efficient Targeted DNA Editing. MBio 6, e01714-01715, doi:10.1128/mBio.01714-15 (2015).
11 Lei, C. et al. The CCTL (Cpf1-assisted Cutting and Taq DNA ligase-assisted Ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro. Nucleic Acids Res, doi:10.1093/nar/gkx018 (2017).
12 Zhou, J., Wu, R., Xue, X. & Qin, Z. CasHRA (Cas9-facilitated Homologous Recombination Assembly) method of constructing megabase-sized DNA. Nucleic Acids Res 44, e124, doi:10.1093/nar/gkw475 (2016).