CRISPR小知识：CRISPR基因组编辑原理
前两期内容，小编在公众号里简单介绍了CRISPR的发现历史、CRISPR免疫机理和分类，接下来我们重点介绍CRISPR的技术应用。

由于目前基于CRISPR的应用绝大多数利用了Cas9蛋白，因此先以Cas9为例，说明基因组编辑这一原理。

Cas9完成识别和切割有3个成员参与了这一过程，包括被切割的双链DNA，起引导作用的sgRNA和切开双链作用的Cas9蛋白1-4。第一个成员双链DNA中必须含有PAM（protospacer-adjacent motif）序列，这段短的序列紧挨着sgRNA识别序列，对Cas9的结合与有效切割起到重要作用。比如，最常用的SpCas9（Streptococcus pyogenes）的PAM是NGG5。第二个成员sgRNA实际上是人工改造过的RNA。在天然状态下，引导Cas9切割的guide RNA是由crRNA和tracrRNA组成，而sgRNA是将这两个RNA通过一段接头连成了一个RNA（single guide RNA），同样具有活性功能5。sgRNA可分为3个部分：第一个部分是20 nt左右的序列与靶标DNA互补配对；第二个部分是repeat-antirepeat序列，这段序列本身是tracrRNA互补结合crRNA的部分，同时一部分也对Cas9的活性发挥作用；第三个部分是3个loop3结构，这段序列使sgRNA与Cas9的结合非常关键。虽然有研究发现去掉第三个loop在体外也能很好的发挥活性5，但有些研究显示完整的sgRNA在体内的活性更高6。

Cas9蛋白以及DNA和sgRNA组成的复合体已解析了晶体结构1, 7。从整体看，由内切酶部分（NUC）和α-螺旋识别部分（REC）。其中，NUC部分包含HNH内切酶结构域、RuvC-like内切酶结构域、PAM相互作用结构域（PI）和一个进化上趋异的楔形结构域（WED）。RuvC和NHN结构域分别切割双链DNA的其中一条链；PI结构域与DNA上的PAM序列通过碱基的相互作用，对Cas9的特异性起到非常重要的作用。WED结构域识别sgRNA骨架，不同来源的Cas9的WED差异大，同时它与PAM序列的骨架也有相互作用。螺旋REC部分不同的Cas9差异较大，它包含负责识别gRNA和靶标DNA杂合体的区域，同时也特异性识别sgRNA的骨架。另外，生化实验和结构研究也表明，Cas9作用于DNA并切割的过程中，Cas9的构象会发生一系列的变化。

Cas9介导的基因组编辑需要两个步骤：DNA的切割和DNA的修复。sgRNA引导Cas9与特定的DNA结合，并切割靶标DNA从而引起双链DNA的断裂（DSB）8。双链断裂后，会引发体内两套修复系统的修复，一种是错误倾向的非同源末端连接修复（NHEJ），另一种是精确的同源重组修复（HR）。NHEJ修复方式存在于真核细胞中，少数原核细胞有不同于真核的较简单的NHEJ。NHEJ会在双链断裂的位置附近引起随机的插入或缺失突变，从而会导致基因的失活（例如引起移码突变或关键位置编码蛋白的变化）。因此，HR的修复需要加入一段供体DNA作为模板，通过同源重组原理，进行精确的修复。这种修复方式可以进行基因的敲出、突变、插入或者基因的修正。

2013年，通过生物信息学的分析发现，存在另外一种class 2类型的CRISPR系统；这种假定的type V的系统包含一个约1300个氨基酸的大蛋白，被称为Cpf19，后改称为Cas12a10。2015年，张锋实验室研究发现，Cas12a与Cas9一样都是RNA介导的DNA内切酶，但在许多特性上又不同于Cas9蛋白。首先，Cas12a只需要crRNA即可引导切割，而不需要tracrRNA；它识别的PAM是富含T的序列。另外，Cas12a切割双链DNA后，留下一个5’突出的粘性末端。张锋实验室测试了16个Cas12a家族的蛋白，鉴定了来源于氨基酸球菌属（Acidaminococcus）和毛螺菌属（Lachnospiraceae）的两个Cas12a能在人类细胞中发挥切割活性11。

2016到2017年，陆续有6篇文章解析了Cas12a的蛋白晶体结构，发现了Cas9和Cas12a的几点相似与不同之处12-18。从整体结构来看，Cas12a和Cas9是相似的，同样含有两个裂片（lobe），之间含桥接螺旋序列，以及在两裂片间存在一个中心通道，负责结合crRNA-靶标DNA复合体。虽然两个蛋白的整体结构是相似的，但是从同源性上来看，仅仅RuvC核酸酶结构域存在一定同源性，其余的序列上并没有相似性。其中一个重要的区别是Cas9负责切割的是HNH和RuvC结构域，分别负责切割靶标链（T链）和非靶标链（NT链）。Cas12a由于缺少HNH结构域，取而代之的是Nuc结构域，而且这个结构域与已知的所有蛋白都没有相似结构。起初，研究者认为Cas12a的Nuc和RuvC分别切割双链中的一条链17，但越来越多的证据表明其RuvC和Nuc的部分氨基酸组成了RuvC的催化口袋，靶标DNA的两条链都是由该口袋完成切割15, 16, 18, 19。另外，Emmanuelle等人发现了Cas12a具有切割RNA的特性，它能够将前体crRNA的5’端切割加工，形成成熟的crRNA20。

2015年，同样属于class 2 type V家族的Cas12b（旧称C2c1）被证明拥有切割活性。Cas12b与Cas12a在结构上非常相似，且活性结构域和催化机理可能也是相似的，但Cas12b需要crRNA和tracrRNA19, 21, 22。2016年，Cas13a（旧称C2c2）被证明是靶向RNA的核酸酶，属于class 2 type VI，它与Cas9和Cas12a差异较大，且行使切割功能的是HEPN结构域23。

参考文献：

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20 Fonfara I, Richter H, Bratovic M, Le Rhun A, Charpentier E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature 2016; 532:517-521.
21 Shmakov S, Abudayyeh Omar O, Makarova Kira S et al. Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems. Molecular Cell 2015; 60:385-397.
22 Liu L, Chen P, Wang M et al. C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism. Mol Cell 2017; 65:310-322.
23 Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 2016; 353:aaf5573.