CRISPR免疫机理与分类

还记得上一期的内容吗？上一期讲到了CRISPR的发现故事。这一期我们来介绍一下CRISPR的免疫机理和分类。
CRISPR免疫机理

现已证实，CRISPR系统是许多细菌和大多数古生菌的获得性免疫系统。这些含有CRISPR的菌株首先从侵染它们的噬菌体或质粒获得DNA片段，下次侵染时可转录成CRISPR RNAs（crRNAs）引导切割侵染的RNA或DNA（CRISPR种类不同切割特性也有差异），CRISPR免疫系统由一系列Cas蛋白的参与相应这一过程1, 2。

一般来说，CRISPR系统响应外源侵染的DNA分为三个阶段3。第一个阶段也被称为获取阶段，宿主获取侵染的质粒或噬菌体的DNA片段（术语叫做protospacers）并插入到CRISPR基因座的重复序列中。第二个阶段，Cas蛋白表达，含有spacer的CRISPR序列转录成前体crRNA（pre-crRNA），接着前体crRNA被加工成成熟的crRNA。加工完成的crRNA起引导作用，通过Cas蛋白和其他RNA组分靶向侵染的基因组4。在type II的CRISPR系统中，非编码的tracrRNA与crRNA的重复序列结合，这对crRNA的加工、Cas9蛋白的结合和Cas9介导的靶向切割非常重要。在第三个阶段，Cas蛋白在crRNA的介导下，识别特定的靶标序列并切割靶标序列，从而达到宿主细胞预防侵染的作用。另外，许多CRISPR系统需要在靶标临近存在短的PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列5，这可以避免靶向自身基因组上的spacer序列。

CRISPR的分类

大多数cas基因的快速进化和CRISPR基因座的多样性是注释Cas蛋白和CRISPR-Cas系统分类面临的主要困难7。由于基因组成和CRISPR-Cas系统的基因结构的复杂性，根据进化树、比较基因组和结构等分析的“多元（polythetic）”方法建立了起来。最初，将CRISPR-Cas系统分为三个主要的型（type，type I-type III）。这三种型很容易根据它们的特征基因区分，type I的Cas3，type II的Cas9和type III的Cas107。

经过更深入的测序和结构分析，对CRISPR系统有了进一步的认识。2015年，Makarova等人构建了394位点特异性打分矩阵（PSSM）库，这个库共注释了2751个完整的古细菌和真细菌的CRISPR-Cas系统8。这些分析，将CRISPR系统分为两个class，即class 1和class 2。其中，class 1包括type I，type III和typeIV，它们的共同特征是crRNA效应物是多个蛋白组成的复合体，而class 2则只要一个蛋白即可发挥作用，包括type II的Cas 9，type V的Cas12a和type VI的C2c2。Type I到type V又被进一步分成了16个亚型（subtype）。

参考文献：

1 Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, Siksnys V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A 2012; 109:E2579-2586.
2 Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 2012; 337:816-821.
3 van der Oost J, Westra ER, Jackson RN, Wiedenheft B. Unravelling the structural and mechanistic basis of CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol 2014; 12:479-492.
4 Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, Ehrlich SD. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology 2005; 151:2551-2561.
5 Nishimasu H, Ran FA, Hsu PD et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell 2014; 156:935-949.
6 Wright AV, Nunez JK, Doudna JA. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering. Cell 2016; 164:29-44.
7 Makarova KS, Haft DH, Barrangou R et al. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol 2011; 9:467-477.
8 Makarova KS, Wolf YI, Alkhnbashi OS et al. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol 2015; 13:722-736.
9 Shmakov S, Smargon A, Scott D et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol 2017; 15:169-182.
10 Makarova KS, Zhang F, Koonin EV. SnapShot: Class 2 CRISPR-Cas Systems. Cell 2017; 168:328-328 e321.
11 Ran FA. Adaptation of CRISPR nucleases for eukaryotic applications. Analytical biochemistry 2017; 532:90-94.