CRISPR工具箱：高通量功能性遗传筛选

前几期介绍了CRISPR的基本原理和在基因组编辑方面的应用，那么接下来几期，小编将介绍CRISPR这一强大的工具箱，在除了基因组编辑之外，还有哪些应用呢？本期将介绍CRISPR在高通量筛选方面的应用。

Cas9蛋白只要简单设计的sgRNA就可以靶向特定目标，根据这一原理，基于Cas9的基因组编辑开创了一个新时代。如果根据CRISPR的靶向原理，合成大量的引物，制备成一个大规模文库即可用于功能性遗传筛选。

成池的遗传筛选（pooled genetic screens），是指其中每个细胞在基于表型的选择之前接收到不同的遗传扰动，用于快速鉴定影响所选表型的特定基因组元件的有力技术。一次成功的筛选可以揭示新的基因型-表型之间的对应关系，候选有希望的基因靶标可以进行后续研究。成池筛选的关键是表型选择而导致的与表型相关的遗传扰动的富集（或消耗）。 筛选表型的方式可以是药物的抗性或特定细胞表面受体的表达。以这种方式，成池的筛选可以搜索数千个扰动（例如，基因组尺度）。传统的方式依赖于DNA的突变（比如化学诱导突变，移动元件的插入或辐射）或转录水平的操作，比如RNA干扰技术（RNAi）。然而，用常规的DNA突变进行成池筛选后较难鉴定突变位点，而RNAi目前的筛选目前仍有如不完全失活或脱靶的挑战1。

图 CRISPR文库用于基因操作（图片来源2）。
FIG Applications of CRISPR libraries for gene manipulation.

最近，来源于微生物中的免疫系统（CRISPR）的易编程性提供了以目标方式进行DNA水平筛选的新机会2,3。使用这种RNA引导系统产生靶向从而使得靶标功能丧失突变，可以为高通量成池筛选构建大型基因组规模的CRISPR库。 DNA水平的操作与易于靶向/可编程性的组合为在多种功能测定中了解基因组（和表观基因组）元件的功能提供了新的途径。

在过去两年，成池的CRISPR筛选已经在不同的表型测定中进行了试验：抗癌药物耐药性3-5，细菌毒素抗性6，西尼罗病毒诱导细胞死亡7，线粒体代谢8，鉴定和合成致死基因癌细胞系9-11，鉴定转移遗传驱动因子12，并了解免疫细胞中的基因网络13,14。另外，无催化活性的Cas9融合转录激活结构域（sgRNA靶向启动子区域）可以实现基因组范围的功能获得性（gain-of-function）筛选（图1.4）15,16。为了说明CRISPR筛选的实用性，我们将重点介绍功能损失筛选的两个示例：富集筛选和一组相关的筛选。

第一个例子中，在黑色素瘤细胞系中正筛选一个耐药性人类BRAF突变体（V600E），用大约18,000个基因为靶标的文库，大约包含65,000个sgRNA 4。在BRAF突变黑色素瘤细胞中，基因组范围内CRISPR筛选鉴定了以前建立的维莫非尼抗性功能丧失靶标和几种新的基因靶标17,18。重要的是，CRISPR筛选中不同试剂靶向相同基因的一致性高于使用基因组范围的慢病毒RNAi文库的同一筛选18。例如，RNAi筛选中的10个高度富集的基因平均只有20％的情况靶向每个基因，表明设计用于靶向相同基因的不同RNAi之间几乎不一致。CRISPR筛选平均含有80％的针对富含10种高度富集基因的成分。这种一致性的巨大差异表明，使用CRISPR试剂，假阳性率较低（在最近的筛选技术19中的最近详细比较中进一步证实），从而使我们对确定的基因候选者更有信心。来自CRISPR筛选的几个候选物中的个体功能丧失突变显示在随访实验中赋予维甲非霉素抗性4，而来自RNAi筛选的仅一个基因可以被验证18。

自初步发展以来，成池CRISPR筛选为基础生物学和应用、临床相关领域提供了新的见解，但仍有很多机会进一步发展这项技术。虽然体内筛选已经建立了理解细胞和细胞相互作用的第一步12，但是绝大多数CRISPR筛选均采用单细胞进行分离。新筛选可以代替基于细胞的选择性压力（例如，T细胞介导靶向的癌细胞）替代药物选择，或将文库转导的细胞与其他与疾病相关的细胞类型相结合（例如，癌细胞与内皮细胞或免疫细胞共培养）。还可以向不同的细胞群体提供不同的成池的文库，比如从最近的细胞类型特异性基因表达数据（如Genotype Tissue Expression（GTEx）项目和Allen Brain Atlas等）20,21资源中获益。例如，在神经元和神经胶质的共同培养系统中，每种细胞类型可以在共培养之前，分别用特异性文库进行转导（靶向神经元或神经胶质相关基因）。按照类似的细胞系，单个构建物中同时导入两个或多个sgRNA的组合可以允许在一个细胞内靶向多个基因（图1.3）。然而，有必要使用较小的靶向文库来避免这种组合的激增：基因组规模的CRISPR具有105个不同sgRNAs的文库约需要（在103个细胞/构建物）10万亿个无效的细胞筛选出可能的一对sgRNA，但是具有102至103个不同sgRNA的文库在给定当前筛选处理和细胞培养能力方面是可行的。

使用CRISPR与转录激活结构域进行获得功能筛选的成功表明，通过将不同的表观遗传效应结构域融合到催化无活性的CRISPR核酸酶上，可能还有其他种类的筛选。这些可以作用于调节染色质状态或改变特定基因组位置通过融合其他表观遗传元件22,23。另一个考虑是利用核酸酶或其他效应子结构域在基因组中靶向到什么位置。使用成池的CRISPR筛选方法来处理非编码基因组元件是未来方向之一，如非编码RNA（例如，微RNA（miRNA），大型基因间非编码RNAs [lincRNAs]），增强子，阻遏子，启动子和结构元件例如，CCCTC结合因子[CTCF]结合位点）12,24,25。最近，张锋实验室利用全基因组的激活筛选，筛选到了11个lncRNA位点与BRAF的抗性相关，并且解析了其中一个lncRNA（EMICERI）的功能26。基于双重sgRNA的缺失和单个sgRNA筛选有助于定位和理解非编码基因组中的功能元件。从技术的角度来看，大多数CRISPR筛选都聚焦于功能丧失，因为在切片后切割NHEJ介导的DSB修复效率高，但是在某种程度上，在特定位置的精确敲入特定的人类遗传变体（例如，单核苷酸多态性[SNP]，拷贝数变异[CNVs]）将更为所需。虽然在单基因组位点可行，这种精确定位在多个基因组位点尚不能实现。随着基因组工程技术发展速度较快，这可能会很快改变。

与RNAi和其他成池筛选技术相比，CRISPR成池筛选显示了针对相同遗传因素的不同位点之间的较高一致性，也因此，已经得到了广泛的适用性和新的生物学发现。 鉴于许多有希望的未来趋势，CRISPR成池筛选具有巨大的潜力来改善我们对基因组的理解，并确定基因组元件在正常和疾病状态中的作用。

参考文献

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