近年来，CRISPR技术一直被广泛应于用基因编辑领域，随着该系统中部分Cas酶的反式切割活性被发现，该技术也逐渐被广泛应用于新分子诊断方法的开发。在CRISPR RNA (crRNA)的引导下，Cas12a识别靶DNA，形成Cas12a、crRNA和靶DNA的三元复合物，该复合物在系统中对非特异性ssDNA进行反式切割，其活性被命名为“反式切割活性”。研究人员利用Cas12的这些“反式切割活性”，已经成功建立了多个CRISPR-Dx系统，如HOLMES、HOLMESv2和DETECTR等。CRISPR诊断技术(CRISPR-Dx)因其在诊断灵敏度、特异性、简便性和便携性等方面显示出巨大潜力，已被公认为下一代诊断方法。值得注意的是，美国食品和药物管理局(FDA)已经授予Sherlock biosciences紧急使用授权(EUA)，将CRISPR技术用于SARS-CoV-2快速诊断试剂盒；国内也已批准了两个CRISPR新冠检测产品上市，这足以证明CRISPR技术在病原诊断方面的巨大潜力。

然而，由于缺乏统一的反式切割活力单位，在目前的体系中使用的Cas酶通常以浓度而不是酶单位定量。由于不同来源的酶可能因纯化方法不同导致纯度不同，如果以蛋白浓度确定Cas酶的定量，则会导致CRISPR-Dx系统的不稳定性，这无疑将限制CRISPR-Dx技术的大规模工业化应用。近日，来自深圳第二人民医院等多个团队联合吐露港公司一同定义了Cas12a的反式切割活力单位(trans-cleavage units, transU)，这工作对分子诊断行业和基础研究领域具有重要的意义。该工作系统研究了影响Cas12a反式裂解活性的因素，优化了反应体系，最终确定了其反式活力单位。此外，该工作还提供了简化的transU定义标准化操作流程。下面具体介绍一下工作的详细内容。优化探针首先，该文章作者测试了四种长度为6个核苷酸的荧光探针，分别是聚腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)，发现Cas12a反式切割聚C探针的效率最高，但不能切割聚G探针。并且随着ssDNA报告基因序列的加长，催化效率逐渐增加，当序列长度超过8个核苷酸（8C）时达到峰值。

优化缓冲液：由于酶的催化活性受多种反应因素的影响，包括离子、盐浓度、pH值和温度等。为了优化Cas12a反应缓冲液，作者首先比较了几种常用的市售酶反应缓冲液，发现在缓冲液F中Cas12a的反式切割效率最高。进而通过对pH值从3.5到9.6按照0.1增量进行了进一步分析, 最终选择Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)作为基础条件。通过分别加入数十种添加剂，发现聚乙二醇(PEG)、甘油等几种成分明显增强了催化活力，对上述选择的组分进行系统分析后，得到优化后的Cas12a反式裂解反应缓冲液命名为HOLMES buffer 1。与对照缓冲液NEB buffer 3.1相比，HOLMES buffer 1显著提高了Cas12a的反式催化活性和检测灵敏度。

活力单位测定：作者首先建立了将相对荧光单位(RFUs)与底物探针浓度相关联的标准曲线。

然后，使用固定浓度的Cas12a和crRNA与不同浓度的ssDNA底物探针，测定Cas12a的反式活力酶动力学参数，包括vmax、Km和Kcat值

transU的定义：在上述优化的反应条件下，作者将Cas12a反式活力单位(1 transU)定义为：在HOLMES Buffer 1中，总反应体积为20 μL, 37℃反应条件下，1 min内反式切割1 pmol 8C FQ-reporter所需Cas12a的蛋白量。值得注意的是，由于Cas12a的反式切割效率会受到crRNA和靶dsDNA序列的显著影响，因此该研究中严格限制了用来确定transU的crRNA和靶标DNA序列，以建立统一的测定标准。利用该标准，作者测定了吐露港公司的Cas12a产品的反式切割活力，发现吐露港公司的Cas12a蛋白相比于其他公司的Cas蛋白，具有更高的反式切割活力，因此适用于各种CRISPR-Dx体系