CRISPR-Cas用于高通量细菌代谢工程：进展与展望

摘要:

工业菌株的发展需要高工程效率。由于其便利性和严格性，基于CRISPR-Cas的技术大大提高了细菌的基因组工程效率。这使模式宿主大肠杆菌和非模式生物如梭状芽胞杆菌、芽胞杆菌、链霉菌和蓝细菌的代谢工程更加快速，为利用这些生物体作为改良的细胞工厂开辟了新的可能性。来自不同微生物环境的新型Cas9样系统的发现将扩大应用的范围并拓宽其可用于创造新型生产宿主的范围。这篇综述分析了原核生物代谢工程在生物技术相关产品生产中的基础上，利用不同的CRISPR相关的DNA/RNA核酸内切酶变体。

细菌代谢工程与CRISPR-Cas技术

萜类化合物，醇类，氨基酸，有机酸和抗生素等化学物质在制药和营养行业以及燃料和建筑砌块化学品中具有很高的商业价值。大多数这些化合物是由多步代谢途径产生的，通常在自然的基因组环境中受到严格的调控。模式生物，如大肠杆菌，具有良好的代谢、广泛和高通量的分子工具箱和详细的计算机模拟代谢模型。因此，使用它作为宿主可以最大限度地减少所需的工程步骤，并最大限度地提高工程效率。然而，由于许多商业上特殊产品的代谢途径的复杂性，在构建高效生产菌株之前，对工程操作的需求仍然很高。而且，作为生产宿主的模式生物通常不是最理想的，并且使用替代生物可能有益于许多有价值的化学品的生产。基于Cas的基因组工程和沉默工具已启用并加速了复杂的代谢工程和系统级的广泛生物体代谢途径的理解。

图：基于CRISPR-Cas9的细菌细胞工厂的代谢工程。 使用Cas9作为筛选工具进行基因组编辑过程，如重组工程或基于质粒的同源重组已针对多种产品的高效代谢工程。 另外，在基于Cas9的编辑之前，dCas9可用于CRISPRi快速筛选芯片预测的表型。

图：基于CRISPRi增加目标产物生产的代谢工程策略概述。缩略语： C：碳源；I：中间代谢物； B：副产品或生物质；P：目标产品； TI：有毒中间体；R：阻遏物; M：形态。箭头表示细胞内碳流动，其粗细对应于流速。带有虚线轮廓的箭头表示合并路径。（a）抑制导致副产物或生物质形成的竞争性途径，其中（i）表明靶向启动子区的dCas9，导致比（ii）中更强的抑制，其中编码区被靶向。（b）抑制导致产品消耗的竞争途径，其中（i）指示靶向启动子区域的dCas9，导致比（ii）（其中靶向编码区域）更强的抑制。 （c）抑制目标产品通路的阻遏物。 （d）抑制细胞形状/形态基因以增加目标产物的细胞大小和储存容量。 （e）抑制产物途径以改变产品组成或性质。（f）抑制产物途径以防止有毒中间体积积累。

结论

总之，基于CRISPR-Cas的细菌基因组工程的发展提高了系统层面对代谢的洞察，并实现了更快速的菌株改造工程，这对于利用微生物细胞工厂开发生物基经济是至关重要的。 当前的快速发展和未来的应用将进一步扩大CRISPR-Cas基于编码的代谢工程的生物学和应用范围，包括微调工具，适应不同的宿主，扩展到与其他组件如蛋白酶、标记物或活化剂，以及新型Cas系统的发现和开发。