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CC96403 Y2HGold
产品概述
产品描述
Y2HGold 菌株是 Clontech 公司开发的 GAL4 系统酵母双杂实验用菌株，MATa 型，可直接转化质粒或与 MATα型酵母菌株 Y187 通过 mating 操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker 为：trp1，leu2，报告基因为：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1。Y2HGold-GAL4 酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：pGBKT7 和 pGADT7。质粒pGBKT7 的筛选标志为 TRP1，用于表达 DNA-BD (来自酵母转录因子 GAL4N 端 1~174 位氨基酸)与目标蛋白 (Bait)的融合蛋白；质粒 pGADT7 的筛选标志为 LEU，用于表达 AD(GAL4 C 端 768 ~881 位氨基酸)与目标蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4 系统原理：一个完整的酵母转录因子 GAL4 可分为功能上相互独立的两个结构域：位于 N 端 1~174位氨基酸区段的 DNA 结合域 (DNA-BD)和位于 C 端 768~881 位氨基酸区段的转录激活域 (AD)。DNA-BD 能够识别GAL4-responsive gene 的上游激活序列 UAS，并与之结合。而 AD 可以启动 UAS 下游的基因进行转录。BD 和 AD单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的 GAL4 活性，使含有 UAS 的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD 不与 AD 结合，将要检测的蛋白质分别与 BD 和 AD 融合，形成 bait 融合蛋白 (bait -BD)和 prey 融合蛋白 (prey-AD)，如果 bait 和 prey 发生相互作用，就会促使 BD 和 AD 的相互接近，形成完整的 GAL4，从而激活报告基因的转录。Y2HGold 有四个报告基因：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1，分别由三种不同的启动子 (G1，G2，M1) 启动，这三种启动子只有 GAL4 识别的 17 bp 核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。此外新报告基因 AbAr 与以前的营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，也可以降低酵母双杂假阳性发生的概率。Y2HGold 感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7 质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
产品组分
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组分 |
CC96403-01 |
储存条件 |
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Y2HGold Competent Cells |
10支 × 100 μL |
-80℃，3个月 |
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pGADT7 (control vector, 10 ng/μL) |
1支 × 10 μL |
-80℃，12个月 |
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Carrier DNA (10 μg/μL) |
1支 × 100 μL |
-20℃，12个月 |
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PEG/LiAC |
1支 × 5 mL |
4℃，12个月 |
基因型：MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ, LYS2::GAL1UAS-Gal1TATA-His3, GAL2UAS-Gal2TATA-Ade2 URA3::MEL1UAS-Mel1TATA AUR1-C MEL1
使用方法
1. 变性Carrier DNA：95℃，5 min，立刻冰浴5min，重复一次，然后插入冰中备用。
2. 从-80℃取出Y2HGold感受态细胞，冰上融化，依次加入预冷的目的质粒 2-5 µg，已变性的Carrier DNA 10 µL，PEG/LiAc 500 µL,吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将EP管于42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 3500 rpm离心1 min弃上清，500 µL ddH2O重悬，离心1 min弃上清。
5. 50 µL ddH2O重悬，涂板，30℃培养 48-96 h。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 同时转化 2-3 种质粒时可增加质粒的用量。
4. Y2HGold 酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为 27-30℃；高于 31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的 Adenine 被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine 以供利用，然而，有些菌株的 ADE2 基因被破坏，Adenine 合成途径受阻；又由于其 ADE4,5,6,7,8 基因均正常，所以造成中间产物 P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比 YPDA 培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢。
保存条件
Y2HGold Competent Cells可-80℃保存3个月；pGADT7可-80℃保存12个月；Carrier DNA可-20℃保存12个月；PEG/LiAC可4℃保存12个月。干冰运输，请勿将AH109 Competent Cells置于-20℃或者液氮中保存!
常见问题解答
参考文献
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