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CC96402 Y1HGold
产品概述
产品描述
Y1HGold 菌株是 Clontech 公司开发的 GAL4-AbA 酵母单杂系统用菌株，MATα型，可直接转化质粒进行筛库试验。Transformation marker 为：ura3，leu2；报告基因为：AbAr。Y1HGold-GAL4-AbA 酵母单杂系统需要两种质粒配套使用：pAbAi 和 PGADT7。质粒 pAbAi 的筛选标志为URA，用于表达 pBait-AbAi construct (1~3个 bait DNA 序列重复串联后克隆到 pAbAi 中)；质粒 pGADT7 的筛选标志为 LEU，用于表达 AD(GAL4 C 端768~881 位氨基酸)与目标蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4-AbA 酵母单杂系统原理：Aureobasidin A (AbA)是一种环酯肽抗生素，在低浓度 (0.1-0.2 µg/mL)下即可对酵母产生毒性。基因组中整合了 pBait-AbAi 的酵母菌株(Bait-Reporter Yeast Strains)，当猎物蛋白 (Prey)结合到诱饵序列 (Bait DNA)上，GAL4 AD 就会激活 AbAr 的表达，从而能够在含有抗生素 AbA 的培养基上生长。AbAr 与营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，可以降低酵母单杂假阳性发生的概率。Y1HGold 感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7 质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
产品组分
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组分 |
CC96402-01 |
储存条件 |
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Y1HGold Competent Cells |
10支 × 100 μL |
-80℃，3个月 |
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pGADT7 (control vector, 10 ng/μL) |
1支 × 10 μL |
-80℃，12个月 |
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Carrier DNA (10 μg/μL) |
1支 × 100 μL |
-20℃，12个月 |
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PEG/LiAC |
1支 × 5 mL |
4℃，12个月 |
基因型：MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, met-, MEL1
使用方法
1. 取 pBait-AbAi 质粒 5µg，BstBI 或 BbsI 酶切 1 小时，回收。
2. 变性Carrier DNA：95℃，5 min，立刻冰浴5min，重复一次，然后插入冰中备用。
3. 从-80℃取出 Y1HGold 感受态细胞，冰上融化，依次加入预冷的线性 pBait-AbAi 质粒 1-5 µg（体积不高于 15 µL），已变性的Carrier DNA 10 µL，PEG/LiAc 500 µL,吸打几次混匀，30℃水浴 30 min (15 min 时翻转 6-8 次混匀)。
4. 将EP管放 42℃水浴 15 min (7.5 min 时翻转 6-8 次混匀)。
5. 3500 rpm离心1 min弃上清，ddH2O 500 µL 重悬，离心 1 min 弃上清。
6. ddH2O 50 µL 重悬，涂 SD/-Ura 平板，30℃培养 72 h。
7. 挑取 5-10 个克隆，用 PCR 方法确定 pBait-AbAi 整合到 Y1HGold 基因组中，PCR 阳性菌株在 SD/-Ura 平板划线，30℃培养 72 h，4℃保存，此菌株即是 Y1HGold[Bait/AbAi] 菌株。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 同时转化 2-3 种质粒时可增加质粒的用量。
4. Y1HGold 酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为 27-30℃；高于 31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的 Adenine 被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine 以供利用，然而，有些菌株的 ADE2 基因被破坏，Adenine 合成途径受阻；又由于其 ADE4,5,6,7,8 基因均正常，所以造成中间产物 P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比 YPDA 培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢。
保存条件
Y1HGold Competent Cells可-80℃保存3个月；pGADT7可-80℃保存12个月；Carrier DNA可-20℃保存12个月；PEG/LiAC可4℃保存12个月。干冰运输，请勿将AH109 Competent Cells置于-20℃或者液氮中保存!
常见问题解答
参考文献
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