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32120 SpCas9 H840A Nickase
产品概述
产品描述
SpCas9来源于 S. pyogenes 菌株，是依赖于crRNA和tracrRNA(或连接后形成的sgRNA)引导的 DNA 内切核酸酶，在靶标双链DNA存在 PAM(NGG)的情况下，特异地切割靶标双链DNA，使DNA双链断裂 并生成平末端。PAM 对于 SpCas9 的识别和切割都是必需的，其切割位点位于目标序列(target sequence)内，离PAM区3个碱基。SpCas9 酶的HNH和RuvC结构域分别负责切割靶标双链DNA中与sgRNA配对和非配对的链。本产品中，SpCas9的H840被突变为A，从而使其HNH结构域失活。因此，SpCas9 H840A Nickase只有RuvC结构域有剪切活性，仅剪切靶标dsDNA中的NTS链，形成单链缺刻。
产品优势
✽ 高纯度
✽ 高灵敏度
✽ 高特异性
产品组分
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组分 |
32120-01 (100 pmol) |
32120-03 (1,000 pmol) |
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100 pmol |
1,000 pmol |
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1 mL |
1 mL |
SpCas9 H840A Nickase (10 μM) a
10 × TOLO Buffer 3a.SpCas9 H840A Nickase浓度为10 μM，即10 pmol/μL，100 pmol规格的总体积为10 μL，1,000 pmol规格的总体积为100 μL；
保存条件
-20℃储存；≤ 0℃运输。
实验流程
1.SpCas9 H840A Nickase 剪切实验
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组分 |
体积 |
终浓度 |
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10 × Tolo Buffer 3 |
2 μL | 1 × |
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10 μM SpCas9 H840A Nickase |
0.5 μL | 250 nM |
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10 μM sgRNA |
0.5 μL | 250 nM |
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1 μM Target dsDNA |
0.5 μL | 25 nM |
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Nuclease-free water |
Up to 20 μL |
◆ SpCas9 H840A Nickase 可在 sgRNA 引导下顺式剪切带有靶位点的超螺旋 DNA(cccDNA), 37°C反应 30 min，产生切刻后的开环 DNA，然后 85°C加热 5 min 灭活。开环 DNA(Nicked, ocDNA)会比原本的超螺旋DNA(cccDNA)电泳迁移速率更慢，因此，可通过琼脂糖凝胶电泳检测 SpCas9 H840A Nickase 对靶标的顺式剪切。
常见问题解答
Q1: nCas9与Cas9有什么区别？
A1: Cas9可识别并剪切dsDNA靶标，其机制涉及HNH和RuvC两个结构域，HNH剪切TS链，RuvC剪切NTS链，两者共同产生dsDNA双链断裂(DSBs)，产生平末端。但nCas9由于H840A或D10A氨基酸突变，导致HNH或RuvC结构域失活，只能切割靶标dsDNA中的一条链，产生单链切口。其中，SpCas9 H840A Nickase只能剪切靶标dsDNA中不与sgRN互补配对的链 (NTS链)；而SpCas9 D10A Nickase只能剪切靶标dsDNA中与sgRNA互补配对的链 (TS链)；此外，还有dCas9，由于H840A和D10A均发生突变，导致dCas9只能结合靶标dsDNA，但不能剪切其中任何一条链。
Q2: nCas9的sgRNA应该如何设计？
A2: nCas9的sgRNA可参照以下序列设计：
5′–NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNUUUCGUGGCUGAGCCACGGUGAAAAAGUUCAACUAUUGCCUGAUCGGAAUAAAAUUGAACGAUAAAGAUCGAGAUUUUG–3′,（下划线表示与特异靶标序列互补配对的spacer区)。
参考文献
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