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32120 SpCas9 H840A Nickase

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32120 SpCas9 H840A Nickase

  • 规 格:
    • 100 pmoL
    • 1,000 pmoL

货 号:

32120


价 格:

¥ 0

¥ 1500


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产品概述

产品描述

SpCas9来源于 S. pyogenes 菌株,是依赖于crRNA和tracrRNA(或连接后形成的sgRNA)引导的 DNA 内切核酸酶,在靶标双链DNA存在 PAM(NGG)的情况下,特异地切割靶标双链DNA,使DNA双链断裂 并生成平末端。PAM 对于 SpCas9 的识别和切割都是必需的,其切割位点位于目标序列(target sequence)内,离PAM区3个碱基。SpCas9 酶的HNH和RuvC结构域分别负责切割靶标双链DNA中与sgRNA配对和非配对的链。本产品中,SpCas9的H840被突变为A,从而使其HNH结构域失活。因此,SpCas9 H840A Nickase只有RuvC结构域有剪切活性,仅剪切靶标dsDNA中的NTS链,形成单链缺刻。

 

产品优势

高纯度
高灵敏度
高特异性

 

产品组分

组分

32120-01 (100 pmol)

32120-03 (1,000 pmol)

SpCas9 H840A Nickase (10 μM) a

100 pmol

1,000 pmol

10 × TOLO Buffer 3

1 mL

1 mL

a.SpCas9 H840A Nickase浓度为10 μM,即10 pmol/μL,100 pmol规格的总体积为10 μL,1,000 pmol规格的总体积为100 μL;

 

保存条件

-20℃储存;≤ 0℃运输。

 

实验流程

1.SpCas9 H840A Nickase 剪切实验

组分

体积 

终浓度 

10 × Tolo Buffer 3

2 μL 1 ×

10 μM SpCas9 H840A Nickase

0.5 μL 250 nM

10 μM sgRNA

0.5 μL 250 nM

1 μM Target dsDNA

0.5 μL 25 nM

Nuclease-free water

Up to 20 μL  

◆ SpCas9 H840A Nickase 可在 sgRNA 引导下顺式剪切带有靶位点的超螺旋 DNA(cccDNA), 37°C反应 30 min,产生切刻后的开环 DNA,然后 85°C加热 5 min 灭活。开环 DNA(Nicked, ocDNA)会比原本的超螺旋DNA(cccDNA)电泳迁移速率更慢,因此,可通过琼脂糖凝胶电泳检测 SpCas9 H840A Nickase 对靶标的顺式剪切。

常见问题解答

Q1: nCas9与Cas9有什么区别?

A1: Cas9可识别并剪切dsDNA靶标,其机制涉及HNH和RuvC两个结构域,HNH剪切TS链,RuvC剪切NTS链,两者共同产生dsDNA双链断裂(DSBs),产生平末端。但nCas9由于H840A或D10A氨基酸突变,导致HNH或RuvC结构域失活,只能切割靶标dsDNA中的一条链,产生单链切口。其中,SpCas9 H840A Nickase只能剪切靶标dsDNA中不与sgRN互补配对的链 (NTS链);而SpCas9 D10A Nickase只能剪切靶标dsDNA中与sgRNA互补配对的链 (TS链);此外,还有dCas9,由于H840A和D10A均发生突变,导致dCas9只能结合靶标dsDNA,但不能剪切其中任何一条链。

 

Q2: nCas9的sgRNA应该如何设计?

A2: nCas9的sgRNA可参照以下序列设计:
5′–NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNUUUCGUGGCUGAGCCACGGUGAAAAAGUUCAACUAUUGCCUGAUCGGAAUAAAAUUGAACGAUAAAGAUCGAGAUUUUG–3′,(下划线表示与特异靶标序列互补配对的spacer区)。

产品说明书

#32120 SpCas9 H840A Nickase Manual

pdf

525.8KB

参考文献

COA查询

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