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32005 10×HOLMES Buffer 1
产品概述
产品描述
10×HOLMES Buffer 1是适用于Cas12蛋白反式切割反应的专用缓冲液。该反应缓冲液的成分经过优化，可有效提升Cas12蛋白的反式切割活性，而不影响其检测靶标的特异性，因此，可被用于Cas12介导的CRISPR诊断反应体系。常见的Cas12家族蛋白，如Cas12a（Cpf1）、Cas12b（C2c1）和Cas12f（Cas14）等，均可使用HOLMES Buffer 1作为反应缓冲液。
实验流程
以LbCas12a反式剪切实验为例(20 µL反应体系，需加入10×HOLMES Buffer 1的体积为2 µL)：
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组分 |
体积 |
终浓度 |
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10 × HOLMES Buffer 1 |
2 μL |
1 × |
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10 μM LbCas12a Nuclease |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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10 μM crRNA |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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1 μM Target DNA |
0.5~5 μL |
25~250 nM |
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10 μM ssDNA Reporter |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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Nuclease-free Water |
Up to 20 μL |
◆ 反式剪切体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整，用量较少时可先将各组分稀释后加入体系，LbCas12a Nuclease可用1×HOLMES Buffer 1稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的Cas12酶长期保存，请使用Cas12 Dilution Buffer，#32012），crRNA、Target DNA及ssDNA Reporter可用Nuclease-free Water稀释，但极低浓度的Target DNA（例如LOD实验）建议用0.1% Tween 20稀释并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。
实时荧光定量PCR仪检测荧光信号，37℃反应，每30 sec采集一次荧光信号。
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组分 |
32005 |
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● 10×HOLMES Buffer 1 |
5×1 mL |
a.SpCas9 H840A Nickase浓度为10 μM，即10 pmol/μL，100 pmol规格的总体积为10 μL，1,000 pmol规格的总体积为100 μL；
保存条件
4℃储存；常温运输。
常见问题解答
Q1: nCas9与Cas9有什么区别？
A1: Cas9可识别并剪切dsDNA靶标，其机制涉及NHN和RuvC两个结构域，NHN剪切TS链，RuvC剪切NTS链，两者共同产生dsDNA双链断裂(DSBs)，产生平末端。但nCas9由于H840A或D10A氨基酸突变，导致HNH或RuvC结构域失活，只能切割靶标dsDNA中的一条链，产生单链切口。其中，SpCas9 H840A Nickase只能剪切靶标dsDNA中不与sgRN互补配对的链 (NTS链)；而SpCas9 D10A Nickase只能剪切靶标dsDNA中与sgRNA互补配对的链 (TS链)；此外，还有dCas9，由于H840A和D10A均发生突变，导致dCas9只能结合靶标dsDNA，但不能剪切其中任何一条链。
Q2: nCas9的sgRNA应该如何设计？
A2: nCas9的sgRNA可参照以下序列设计：
5′–UUUCGUGGCUGAGCCACGGUGAAAAAGUUCAACUAUUGCCUGAUCGGAAUAAAAUUGAACGAUAAAGAUCGAGAUUUUGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3′,（下划线表示与特异靶标序列互补配对的spacer区)。
参考文献
COA查询
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