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32005 10×HOLMES Buffer 1

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32005 10×HOLMES Buffer 1

  • 规 格:
    • 5×1 mL

货 号:

32005


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产品概述

产品描述

10×HOLMES Buffer 1是适用于Cas12蛋白反式切割反应的专用缓冲液。该反应缓冲液的成分经过优化,可有效提升Cas12蛋白的反式切割活性,而不影响其检测靶标的特异性,因此,可被用于Cas12介导的CRISPR诊断反应体系。常见的Cas12家族蛋白,如Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)和Cas12f(Cas14)等,均可使用HOLMES Buffer 1作为反应缓冲液。

 

实验流程

以LbCas12a反式剪切实验为例(20 µL反应体系,需加入10×HOLMES Buffer 1的体积为2 µL):

组分

体积

终浓度

10 × HOLMES Buffer 1

2 μL

1 ×

10 μM LbCas12a Nuclease  

0.05~0.5 μL

25~250 nM

10 μM crRNA 

0.05~0.5 μL

25~250 nM

1 μM Target DNA

0.5~5 μL

25~250 nM

10 μM ssDNA Reporter 

0.05~0.5 μL

25~250 nM

Nuclease-free Water

Up to 20 μL

 

◆ 反式剪切体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整,用量较少时可先将各组分稀释后加入体系,LbCas12a Nuclease可用1×HOLMES Buffer 1稀释,稀释后需立即使用(若要稀释后的Cas12酶长期保存,请使用Cas12 Dilution Buffer,#32012),crRNA、Target DNA及ssDNA Reporter可用Nuclease-free Water稀释,但极低浓度的Target DNA(例如LOD实验)建议用0.1% Tween 20稀释并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。
实时荧光定量PCR仪检测荧光信号,37℃反应,每30 sec采集一次荧光信号。

组分

32005 

● 10×HOLMES Buffer 1

5×1 mL

a.SpCas9 H840A Nickase浓度为10 μM,即10 pmol/μL,100 pmol规格的总体积为10 μL,1,000 pmol规格的总体积为100 μL;

 

保存条件

4℃储存;常温运输。

 

常见问题解答

Q1: nCas9与Cas9有什么区别?

A1: Cas9可识别并剪切dsDNA靶标,其机制涉及NHN和RuvC两个结构域,NHN剪切TS链,RuvC剪切NTS链,两者共同产生dsDNA双链断裂(DSBs),产生平末端。但nCas9由于H840A或D10A氨基酸突变,导致HNH或RuvC结构域失活,只能切割靶标dsDNA中的一条链,产生单链切口。其中,SpCas9 H840A Nickase只能剪切靶标dsDNA中不与sgRNA互补配对的链 (NTS链);而SpCas9 D10A Nickase只能剪切靶标dsDNA中与sgRNA互补配对的链 (TS链);此外,还有dCas9,由于H840A和D10A均发生突变,导致dCas9只能结合靶标dsDNA,但不能剪切其中任何一条链。

 

Q2: nCas9的sgRNA应该如何设计?

A2: nCas9的sgRNA可参照以下序列设计:
5′–UUUCGUGGCUGAGCCACGGUGAAAAAGUUCAACUAUUGCCUGAUCGGAAUAAAAUUGAACGAUAAAGAUCGAGAUUUUGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3′,(下划线表示与特异靶标序列互补配对的spacer区)。

产品说明书

#32005 10 × HOLMES Buffer 1 Manual

pdf

593.6KB

参考文献

COA查询

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