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24603 One Step Blood Direct PCR Kit

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24603 One Step Blood Direct PCR Kit

  • 规 格:
    • 100 rxns

货 号:

24603


价 格:

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产品概述

产品描述

本试剂盒可直接对全血样本进行PCR,无需DNA纯化或样品预处理。可用于直接扩增的血样类型包括:新鲜血液、4℃贮存血液、冷冻血液以及储存在Whatman903和FTA商用卡上的干血渍,且兼容所有常规抗凝剂(EDTA、柠檬酸盐、肝素等)。该试剂盒的2 × Blood Direct PCR Mix (with Dye)包含特殊修饰的热启动DNA Polymerase,该酶对全血样品中的PCR抑制剂具有超强的抵抗力;配合高度优化的缓冲体系能够从全血样品中高效扩增长达10 kb的基因组片段。反应时只需加入引物和模板即可进行扩增,减少了开盖、移液等操作,显著降低样品交叉污染并且提高了检测通量和结果的可重复性。体系中预混有电泳缓冲液和染料,可在反应结束后直接进行电泳。

 

 

产品组分

组分

24603 (100 rxns) 

2 × Blood Direct PCR Mix (with Dye) a

2 × 1.25 mL

a.组分中已包含 dNTP、Mg2+、DNA Polymerase、Dye等。

 

 

保存条件

-20℃避光保存;≤ 0℃运输。

 

 

产品优势

扩增能力强:  核心组分Taq DNA Polymerase为抗体法修饰的热启动DNA聚合酶,可从全血中高效扩增长达10 kb的DNA片段。

操作方便:PCR反应时只需要引物和模板即可进行扩增。

优化的缓冲体系:有效抑制非特异性扩增和引物二聚体形成。

带蓝色染料:反应结束后产物直接进行电泳,方便快捷。

 

 

实验案例

以人和小鼠-20℃存储的肝素抗凝血为模板,扩增不同长度的DNA片段,PCR结束后琼脂糖凝胶电泳显示,2 × Blood Direct PCR Mix (with Dye)可以高效扩增长达5 kb的片段,说明2 × Blood Direct PCR Mix (with Dye)具有优异的扩增性能。

2 × Blood Direct PCR Mix (with Dye) 分别于-20°C、4°C、37°C、50 °C存放7天,然后以牛、人、鼠来源的血液样本为模板,直接扩增长度为273 bp的一段序列。实验结果表明,2 × Blood Direct PCR Mix (with Dye)对小片段的扩增效率在4°C、37°C、50 °C 存放7天的条件下并未明显下降,说明ToloBio #24603具有较高的稳定性。

 

 

实验流程

1.PCR扩增体系配制

组分

体积 

2 × Blood Direct PCR Mix (with Dye)

25 μL

Primer F (10 μM)

2 μL

Primer R (10 μM)

2 μL

血样

x μL

ddH2O

Up to 50 μL

· 最适血样模板用量为体系总体积的1% ~20%,推荐使用10%作为初始尝试条件,即50 μl的反应体系内加入5 μl血样;

· 吸取抗凝血,尤其是长期存放过的抗凝血时,应尽量避免吸取血液凝块;

· 若样本是贮存在Whatman滤纸卡上的干血渍,则可取约1 mm2带血渍的圆纸片,将其直接放入PCR反应液中,无需预处理;

· 引物终浓度为0.2~0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时,可在 0.1~0.5 μM 范围内调整引物浓度;

· 配制好PCR反应体系后,请置于涡旋仪上涡旋混匀,瞬时离心将反应液集于管底。

 

2.PCR反应程序设定

Stage

程序 

温度 

时间 

循环 

Stage 1

预变性 b 95℃ 5 min 1 cycle

Stage 2

循环反应 c  95℃ 15 sec 35 cycles
55 ~ 72℃ 15 sec
72℃ 30 sec/kb

Stage 3

彻底延伸 d 72℃ 5 min 1 cycle

a.预变性(95℃, 5min)可以让白细胞裂解,释放可用于PCR扩增的基因组DNA。请勿缩短时间或降低温度;

b.退火温度需要根据引物Tm值进行调整,一般设置为低于引物Tm值2~5℃即可。若扩增产物特异性较差,可适当提高退火温度;

c.延伸时间根据扩增片段长度按30 sec/kb设定,最低设置为15 sec;不超过10 kb的片段扩增都可以按30 sec/kb设定。

 

3.PCR扩增产物分析

PCR反应结束后,建议将扩增产物于4,000 rpm (1,000×g)离心1~3 min以沉淀血细胞碎片,之后取3~5 μL上清液直接进行琼脂糖凝胶电泳检测。本产品中已经预混有电泳缓冲液和染料,因此扩增产物无需再添加DNA Loading Buffer。

常见问题解答

Q1: 扩增产量低或无扩增产物

A1: 
(1)模板加入量不合适:降低血液用量或增大PCR反应体系。
(2)PCR反应体系或程序出错:重新配制实验,确保PCR反应体系配制无误;确保反应程序设置无误。
(3)PCR程序不合适:增加PCR循环数以获得更多的扩增产物;降低PCR循环反应中的退火温度(每次降低3℃)。
(4)PCR引物错配严重:重新设计引物,并设置已纯化过的基因组为模板的阳性对照。
(5)PCR试剂盒保存不当失去活性:2×Blood Direct PCR Mix (with Dye) 应保存于-20℃,使用时避免反复冻融。若使用频繁,短时间可在4℃存放。

 

Q2:非特异性扩增

A2:
(1)引物浓度过高:降低引物浓度。
(2)PCR引物错配:重新设计引物,引物3'端最后一个碱基选择C或G;最后8个碱基应避免出现连续错配;引物3'端尽量避免出现发夹结构;引物Tm值控制在60℃-72℃之间,GC含量控制在40%-60%之间,且正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。
(3)PCR扩增反应退火温度设置太低:提高退火温度(每次提高2℃)。
(4)PCR循环数过多:减少PCR循环数。
(5)PCR反应体系在室温下配制:冰上配制反应体系可显著降低非特异性扩增。

 

Q3:阴性对照出现目的条带

A3:
(1)PCR体系出现污染:逐个更换PCR反应体系中的每一个组分。
(2)操作工具污染:实验所有试剂或器材均应高温高压灭菌。

 

 

产品说明书

#24603 One Step Blood Direct PCR Kit Manual

pdf

895.6KB

参考文献

COA查询

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