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24603 One Step Blood Direct PCR Kit
产品概述
产品描述
本试剂盒可直接对全血样本进行PCR，无需DNA纯化或样品预处理。可用于直接扩增的血样类型包括：新鲜血液、4℃贮存血液、冷冻血液以及储存在Whatman903和FTA商用卡上的干血渍，且兼容所有常规抗凝剂（EDTA、柠檬酸盐、肝素等）。该试剂盒的2 × Blood Direct PCR Mix (with Dye)包含特殊修饰的热启动DNA Polymerase，该酶对全血样品中的PCR抑制剂具有超强的抵抗力；配合高度优化的缓冲体系能够从全血样品中高效扩增长达10 kb的基因组片段。反应时只需加入引物和模板即可进行扩增，减少了开盖、移液等操作，显著降低样品交叉污染并且提高了检测通量和结果的可重复性。体系中预混有电泳缓冲液和染料，可在反应结束后直接进行电泳。
产品优势
✽ 扩增能力强: 核心组分Taq DNA Polymerase为抗体法修饰的热启动DNA聚合酶，可从全血中高效扩增长达10 kb的DNA片段。
✽ 操作方便：PCR反应时只需要引物和模板即可进行扩增。
✽ 优化的缓冲体系：有效抑制非特异性扩增和引物二聚体形成。
✽ 带蓝色染料：反应结束后产物直接进行电泳，方便快捷。
实验案例
以人和小鼠-20℃存储的肝素抗凝血为模板，扩增不同长度的DNA片段，PCR结束后琼脂糖凝胶电泳显示，2 × Blood Direct PCR Mix (with Dye)可以高效扩增长达5 kb的片段，说明2 × Blood Direct PCR Mix (with Dye)具有优异的扩增性能。
将2 × Blood Direct PCR Mix (with Dye) 分别于-20°C、4°C、37°C、50 °C存放天，然后以牛、人、鼠来源的血液样本为模板，直 接扩增长度为273 bp的一段序列。实验结果表明，2 × Blood Direct PCR Mix (with Dye)对小片段的扩增效率在4°C、37°C、50 °C 存放天的条件下并未明显下降，说明ToloBio #24603具有较高的稳定性。
实验流程
1.PCR扩增体系配制
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组分 |
体积 |
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2 × Blood Direct PCR Mix (with Dye) |
25 μL |
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Primer F (10 μM) |
2 μL |
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Primer R (10 μM) |
2 μL |
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血样 |
x μL |
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ddH2O |
Up to 50 μL |
◆ 最适血样模板用量为体系总体积的1% ~20%，推荐使用10%作为初始尝试条件，即50 μl的反应体系内加入5 μl血样；
◆ 吸取抗凝血，尤其是长期存放过的抗凝血时，应尽量避免吸取血液凝块；
◆ 若样本是贮存在Whatman滤纸卡上的干血渍，则可取约1 mm2带血渍的圆纸片，将其直接放入PCR反应液中，无需预处理；
◆ 引物终浓度为0.2~0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可在 0.1~0.5 μM 范围内调整引物浓度；
◆ 配制好PCR反应体系后，请置于涡旋仪上涡旋混匀，瞬时离心将反应液集于管底。
2.PCR反应程序设定
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Stage |
程序 |
温度 |
时间 |
循环 |
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Stage 1 |
预变性 a |
95℃ |
5 min |
1 cycle |
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Stage 2 |
循环反应 b |
95℃ |
15 sec |
35 cycles |
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55~72℃ |
15 sec |
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72℃ |
30 sec/kb |
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Stage 3 |
彻底延伸 c |
72℃ |
5 min |
1 cycle |
a.预变性(95℃, 5min)可以让白细胞裂解，释放可用于PCR扩增的基因组DNA。请勿缩短时间或降低温度；
b.退火温度需要根据引物Tm值进行调整，一般设置为低于引物Tm值2~5℃即可。若扩增产物特异性较差，可适当提高退火温度；
c.延伸时间根据扩增片段长度按30 sec/kb设定，最低设置为15 sec；不超过10 kb的片段扩增都可以按30 sec/kb设定。
3.PCR扩增产物分析
PCR反应结束后，建议将扩增产物于4,000 rpm (1,000×g)离心1~3 min以沉淀血细胞碎片，之后取3~5 μL上清液直接进行琼脂糖凝胶电泳检测。本产品中已经预混有电泳缓冲液和染料，因此扩增产物无需再添加DNA Loading Buffer。
产品组分
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组分 |
24603 (100 rxns) |
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● 2 × Blood Direct PCR Mix (with Dye) d |
2 × 1.25 mL |
d.组分中已包含 dNTP、Mg2+、DNA Polymerase、Dye等。
保存条件
-20℃避光保存；≤ 0℃运输。
常见问题解答
Q1: 扩增产量低或无扩增产物
A1:
（1）模板加入量不合适：降低血液用量或增大PCR反应体系。
（2）PCR反应体系或程序出错：重新配制实验，确保PCR反应体系配制无误；确保反应程序设置无误。
（3）PCR程序不合适：增加PCR循环数以获得更多的扩增产物；降低PCR循环反应中的退火温度（每次降低3℃）。
（4）PCR引物错配严重：重新设计引物，并设置已纯化过的基因组为模板的阳性对照。
（5）PCR试剂盒保存不当失去活性：2×Blood Direct PCR Mix (with Dye) 应保存于-20℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，短时间可在4℃存放。
Q2：非特异性扩增
A2：
（1）引物浓度过高：降低引物浓度。
（2）PCR引物错配：重新设计引物，引物3’端最后一个碱基选择C或G；最后8个碱基应避免出现连续错配；引物3’端尽量避免出现发夹结构；引物Tm值控制在60℃-72℃之间，GC含量控制在40%-60%之间，且正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。
（3）PCR扩增反应退火温度设置太低：提高退火温度（每次提高2℃）。
（4）PCR循环数过多：减少PCR循环数。
（5）PCR反应体系在室温下配制：冰上配制反应体系可显著降低非特异性扩增。
Q3：阴性对照出现目的条带
A3：
（1）PCR体系出现污染：逐个更换PCR反应体系中的每一个组分。
（2）操作工具污染：实验所有试剂或器材均应高压灭菌。
参考文献
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