产品中心
22211 2 × HRM qPCR Master Mix (Universal)
产品概述
产品描述
高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting, HRM) 分析是一种PCR后分析方法，能够很好的区分扩增产物之间单个碱基的差异。
2 × HRM qPCR Master Mix预混液包含新型PureTaq DNA Polymerase和高度优化的缓冲液系统，以及专为HRM应用而开发的饱和染料，具有分辨率高、模板适应性高、配制方便快捷等诸多优势。此外，本试剂盒中中含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适用于所有型号的qPCR仪器。
产品优势
✽ 广泛的平台适用性：含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适用于所有型号的qPCR仪器，无需根据不同仪器调整ROX浓度。
✽ 分辨率高：2×HRM qPCR Master Mix (Universal)中混有饱和染料，其在饱和状态下具有很高的熔解曲线分辨率，可以很好的区分单个碱基的差异。
✽ 优异的特异性和灵敏度： 2 × HRM qPCR Master Mix预混液包含新型抗体法修饰的热启动PureTaq DNA Polymerase和高度优化的缓冲液体系，具有优异的特异性和灵敏度。
✽ 使用方便快捷：本产品为2×premix预混液，只需加入模板和引物即可，操作方便快捷，减少操作过程带来的污染。
✽ 适用范围广：可用于已知SNP分析、DNA甲基化、未知突变基因扫描分析等研究。
实验流程
1.在qPCR管中配制如下反应体系
|
组分 |
体积 |
|
2 × HRM qPCR Master Mix (Universal) |
10 μL |
|
Primer F (10 μM) |
0.6 μL |
|
Primer R (10 μM) |
0.6 μL |
|
Template DNA/cDNA |
x μL |
|
ddH2O |
Up to 20 μL |
反应体系中各成分的量可根据以下原则自行调整：
◆ —般来说反应体系中引物终浓度为0.3 mM即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时，可以在终浓度范围0.1-1.0 μM内调整引物浓度。
◆ qPCR灵敏度极高，建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响。推荐将模板稀释后加入反应体系中，这样可以有效提高实验的准确度。
◆ 如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。
◆ 由于HRM反应较灵敏，须尽量保持不同样本间有相同的模板量。
2.按下列反应程序进行qPCR反应
|
Stage |
程序 |
温度 |
时间 |
循环 |
|
Stage 1 |
预变性 a |
95℃ |
2 min |
1 cycle |
|
Stage 2
|
变性 |
95℃ |
10 sec |
40 cycles
|
|
延伸 b |
60℃ |
30 sec |
||
|
Stage 3
|
异源双链形（可选）
|
95℃ |
30 sec |
1 cycle
|
|
50℃ |
30 sec |
|||
|
Stage 4 |
熔解曲线 c |
65℃ |
以0.1℃/ s的速度升高温度 |
1 cycle |
a．该预变性条件适合绝大多数扩增反应；当模板结构复杂时，可将预变性时间延长至3 min以提高预变性效果。
b．对于300 bp以内的扩増子，延伸时间设置为30 sec即可；超过300 bp的扩增子，建议延长延伸时间至60 sec。延伸步骤与熔解曲线步骤均为信号采集步骤。
c．熔解曲线起始温度可根据扩增产物（非引物序列）的Tm值设定。
产品组分
|
组分 |
22211 (500 rxns) |
|
2× HRM qPCR Master Mix (Universal) d |
5 × 1 mL |
d.包含：dNTP、Mg2+、PureTaq DNA Polymerase、Taq antibody、ROX等。
保存条件
-20℃避光保存，≤ 0℃避光运输；
常见问题解答
Q1: 扩增曲线形状异常
A1:
1.1扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。
1.2扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于Ct值。减小基线终点（Ct值减4），重新分析数据。
1.3个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡。处理样本时要注意离心，进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。
Q2: 反应结束无扩增曲线出现
A2:
2.1 反应循环数不够：一般设置循环数为40, 但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。
2.2确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
2.3确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解的可能。
2.4模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
2.5模板降解：重新制备模板，重复实验。
Q3: Ct值出现太晚
A3:
3.1扩增效率极低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计合成引物。
3.2板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
3.3模板降解：重新制备模板，重复实验。
3.4 PCR产物太长：较短的PCR产物可提高HRM的分辨率，推荐产物长度为80-120 bp之间，SNP位点尽量处在PCR产物序列中间位置。
3.5体系中存在PCR抑制剂：一般为模板带入，加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。
Q4: 阴性对照出现明显扩增
A4:
4.1反应体系污染：更换新的Master Mix、水、引物重复实验。反应体系在超净工作台内配置，减少气溶胶污染。
Q5: 绝对定量时标准曲线线性关系不佳
A5:
5.1加样误差：提高模板稀释倍数，提高加样体积。
5.2标准品降解：重新制备标准品，重复实验。
5.3模板浓度太高：提高模板稀释倍数。
Q6: 实验重复性差
A6:
6.1加样体积不准：使用性能较好移液器或将模板多倍稀释后再提高加入反应体系的模板体积。
6.2定量PCR仪不同位置温度控制不一致：定期校准仪器。
6.3模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。
参考文献
COA查询
相关产品
