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22205 2 × Q3 Probe qPCR Master Mix (Universal)
产品概述
产品描述
本产品是使用探针法进行qPCR反应的专用预混液。其核心组分MegaTaq DNA Polymerase为一种新型的抗体法修饰的热启动DNA聚合酶，具有特异性强、检测灵敏度高等诸多优点，配以针对探针法qPCR优化的最适反应缓冲液，并可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线。本产品对靶基因定量准确、重复性好、可信度高，非常适合进行高特异性、高灵敏度的qPCR反应。此外，本产品中还含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适用于所有型号的qPCR仪器，无需在不同的机型上调整ROX的浓度，只需在配制反应体系时加入引物和模板即可，操作简便！
产品优势
✽ 严谨的热启动DNA聚合酶：核心组分MegaTaq DNA Polymerase为一种新型的抗体法修饰的热启动DNA聚合酶，配以针对qPCR优化的最适反应缓冲液，具有特异性高、检测灵敏度高等优点。
✽ 稳健的重复性：重复可靠的定量结果，满足高水平杂志的数据要求。
✽ 极度优化的缓冲体系：可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，靶基因定量准确、重复性好、可信度高。
实验案例
2 × Q3 Probe qPCR Master Mix (Universal)适用于探针法qPCR的多重检测，在本实验中，我们采用鲍曼不动杆菌、肺炎支原体、A族链球菌和脑膜炎奈瑟球菌为待测样本，以及带有不同荧光基团标记的探针，实现了探针法 的四重检测。实验结果表明，2 × Q3 Probe qPCR Master Mix (Universal)可适用于多重体系，其扩增稳定性更强，在不同浓度梯度模板条件下展示出优异的定 量结果。
实验流程
1.在qPCR管中配制如下反应体系：
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组分 |
体积 |
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2 x Q3 Probe qPCR Master Mix (Universal) |
10 μL |
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Primer F (10 μM) |
0.4 μL |
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Primer R (10 μM) |
0.4 μL |
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Probe (10 μM) |
0.2 μL |
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Template DNA/cDNA |
x μL |
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ddH2O |
Up to 20 μL |
反应体系中各成分的量可根据以下原则自行调整：
◆ —般来说反应体系中引物终浓度为0.2 mM即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时，可以在终浓度范围0.1~1.0 μM内调整引物浓度。
◆ 使用的探针浓度需要根据Real-time PCR扩增仪器及探针类型进行设定，推荐的探针终浓度为50~300 nM，具体请参照仪器说明书及探针附带的说明书。
◆ qPCR灵敏度极高，建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响。建议将模板稀释后加入反应体系中，可以有效提高实验的准确度。
◆ 如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。
2.按下列反应程序进行qPCR反应
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Stage |
程序 |
温度 |
时间 |
循环 |
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Stage 1 |
预变性 a |
95℃ |
30 sec |
1 cycle |
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Stage 2 |
循环反应 b |
95℃ |
10 sec |
40 cycles |
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60℃ |
30 sec |
a.化学修饰的Taq DNA Polymerase需要较长时间的热激活处理，但本试剂盒中采用的MegaTaq DNA Polymerase为抗体修饰，因此仅需预变性30 sec。
b.对于300 bp以内的扩增子，延伸时间设置为30 sec即可；超过300 bp的扩增子，推荐延长延伸时间至60 sec。
产品组分
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组分 |
22205 (500 rxns) |
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○ 2 × Q3 Probe qPCR Master Mix (Universal) c |
5 × 1 mL |
c.组分中包含dNTP、Mg2+、MegaTaq DNA Polymerase、ROX Passive Reference Dye等。
保存条件
-20℃保存，≤ 0℃运输；
常见问题解答
Q1: 扩增曲线形状异常
A1:
1.1扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。
1.2扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于Ct值。减小基线终点（Ct值减4），重新分析数据。
1.3个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡。处理样本时要注意离心，进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。
Q2: 反应结束无扩增曲线出现
A2:
2.1 反应循环数不够：一般设置循环数为40, 但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。
2.2确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
2.3确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解的可能。
2.4模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
2.5模板降解：重新制备模板，重复实验。
Q3: Ct值出现太晚
A3:
3.1扩增效率极低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计合成引物。
3.2模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
3.3模板降解：重新制备模板，重复实验。
3.4 PCR产物太长：推荐PCR产物长度为80-150 bp。
3.5体系中存在PCR抑制剂：一般为模板带入，加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。
Q4: 阴性对照出现明显扩增
A4:
4.1反应体系污染：更换新的Master Mix、水、引物重复实验。反应体系在超净工作台内配置，减少气溶胶污染。
Q5: 绝对定量时标准曲线线性关系不佳
A5:
5.1加样误差：提高模板稀释倍数，提高加样体积。
5.2标准品降解：重新制备标准品，重复实验。
5.3模板浓度太高：提高模板稀释倍数。
Q6: 实验重复性差
A6:
6.1加样体积不准：使用性能较好移液器或将模板多倍稀释后再提高加入反应体系的模板体积。
6.2定量PCR仪不同位置温度控制不一致：定期校准仪器。
6.3模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。
参考文献
COA查询
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