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22121 Single Cell Sequence Specific Amplification Kit
产品概述
产品描述
Single Cell Squence Specific Amplification Kit是基于一步RT-PCR的预扩增方法，适用于单细胞或者微量总RNA中转录组的扩增，便于进行单细胞转录组表达差异的分析。本试剂盒实现了RNA提取纯化、逆转录和PCR预扩增反应在同一管内完成，不需要额外的操作，简单高效，还能减少实验误差和污染风险。除了应用于单细胞，本试剂盒亦可适用于2~1,000个细胞的一步扩增，应用时仅需按照细胞数目减少一步扩增的循环数；获得的扩增产物适合于任何实时荧光定量PCR分析法。染料法和探针法qPCR分别推荐ToloBio通用型2 × Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal, #22204)和2 × Q3 probe qPCR Master Mix (Universal, #22205)。
产品优势
✽ 一步法RT-PCR预扩增：细胞裂解、RNA逆转录和PCR扩增在同一管内完成，不需要额外的移管操作。
✽ 一次可扩增500个靶基因：扩增产物适合用任何实时荧光定量PCR仪分析。
实验案例
分别使用ToloBio #22121与竞品Supplier A、Supplier B，对不同浓度的小鼠巨噬细胞进行一步法RT-PCR预扩增，产物进一步qRCR（ToloBio #22204）扩增，比较在相同引物和相同细胞个数条件下的扩增情况，包括扩增灵敏度、扩增线性和扩增平台。结果显示，ToloBio #22121在不同浓度细胞（1～1000个细胞/test）条件下扩增性能稳定、优异。
实验流程
1.Primer Pool的制备
将不同待测基因的扩增引物进行混合，制备成Primer Pool，使各引物的终浓度为0.1 μM。以Bcl-2基因为例，其上、下游引物原浓度均为100 μM，则应各取1 μL加入998 μL RNase-free ddH2O至终体积为1 mL。多个基因引物对的制备依此类推，最多可混合500对不同基因的扩增引物。
2.预扩增反应体系
在RNase-free离心管中冰上配制如下反应体系：
|
组分 |
体积 |
|
2 ×Tolo scAmp Reaction Buffer |
2.5 μL |
|
Primer Pool (0.1 μM) |
0.5 μL |
|
RT/Taq Enzyme Mix |
0.2 μL |
|
Cell sample a |
0.5~1 μL |
|
RNase-free ddH2O |
Up to 5 μL |
a.细胞可储存于PBS缓冲液中。
以上体系（除细胞样本外）充分混匀后冰上放置备用，可加入1~1000个细胞样本。为了使细胞充分破碎，将加入细胞样本的完整体系置于-80℃冰箱2 min，随后3,000 rpm (1,000 × g)室温或4℃离心2 min，然后立即放入PCR仪进行如下反应：
|
程序 |
温度 |
时间 |
循环数 |
|
反转录 |
50℃ |
60 min |
1 cycle |
|
预变性 |
95℃ |
3 min |
1 cycle |
|
循环反应 b
|
95℃ |
15 sec |
20 cycles
|
|
60℃ |
15 min |
||
|
Hold |
4℃ |
- |
- |
b.建议循环数随起始细胞数量作相应调整：1个细胞20个循环，10个细胞17个循环，100个细胞14个循环，1,000个细胞11个循环。
反应结束后，每管加入20 μL RNase-free ddH2O (1:5稀释)，用移液器吹打混匀，室温短离集于管底。可立即进行后续qPCR定量反应或-20℃短期保存。
3.qPCR反应体系
冰上配制如下反应体系：
|
组分 |
体积 |
|
2 × Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal,#22204) |
10 μL |
|
Primer F (10 μM) |
0.5 μL |
| Primer R (10 μM) |
0.5 μL |
|
Template DNA c |
1 μL |
|
ddH2O |
Up to 20 μL |
c.为减少加样误差，建议将1:5稀释的预扩增产物再稀释10倍后使用。
以上体系充分混匀后，短暂离心集于管底，随后立即放入qPCR仪进行如下反应：
|
Stage |
程序 |
温度 |
时间 |
循环数 |
|
Stage 1 |
预变性 |
95℃ |
5 min |
1 cycle |
|
Stage 2
|
循环反应
|
95℃ |
10 sec |
40 cycles
|
|
60℃ |
30 sec |
|||
|
Stage 3 |
熔解曲线 |
仪器默认程序 |
|
1 cycle |
产品组成
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组分 |
22121 (200 rxns) |
|
● 2 × Tolo scAmp Reaction Buffer d |
500 μL |
|
● RT/Taq Enzyme Mix e |
40 μL |
|
○ RNase-free ddH2O |
2 × 1 mL |
d.包含 dNTP；
e.包含RTase、RNase inhibitor和Taq DNA polymerase；
保存条件
-20℃保存，≤ 0℃运输；
常见问题解答
Q1：5 μl反应体系加入多少体积的样本？
A1：5 μl的反应体系下，加入的样本体积最好不要超过0.5 μl，如果样本体积较大，建议适当增大反应体系。
Q2：整个体系能否减半？
A2：可以，但是不建议，一步法体系较为复杂，大体系做效果更好。
Q3：可以适用于一个细胞的定量吗？检测的基因数量最多可以达到多少？会不会造成扩增偏好性？
A3：单细胞是可以的，亦可用于2-1000 cells或10 pg-100 ng RNA的样品；最多可混合500对不同基因的扩增引物；关于扩增偏好性，只要根据细胞数控制好循环数，不会造成偏好性。
Q4：样本不是分散开的细胞，而是一小块组织，可不可以用呢？组织是否可用裂解液进行裂解细胞？
A4：可以的，但是组织块不能太大，大约有几十个细胞量的组织块是可以的，但是超过这个范围，目前还没有案例。该产品反应体系只有5 μl，不兼容细胞裂解液，大量的裂解液会影响反应的进行，可以将组织进行液氮速冻，直接投入到反应体系即可。
Q5：引物可以使用Oligo dT或随机引物吗？
A5：不可以，因为该产品是RNA提取纯化、逆转录和PCR反应在同一管内完成，如果使用Oligo dT或随机引物无法达到预扩增的目的。
Q6：引物设计有何要求？
A6：
6.1 除了要符合常规的PCR引物设计要求外，还要注意区分外显子和内含子。
6.2 如果引物池存在2对以上的引物时，退火温度建议都是60℃左右。
Q7：逆转录时间设置为60 min，时间太长，是否可以缩短？退火、延伸这一步骤15 min，循环数20，可以把延伸时间和循环数调节一下？
A7：逆转录时间与扩增的基因数目也有关，最保险的是使其进行充分的逆转录，60 min可以保证充分逆转录。延伸时间可以根据后期要测试的基因数量进行调节，这里设置的15 min，是为了彻底逆转录500个基因，后续客户可根据细胞/RNA投入量进行调节；循环数20也是可以根据样本细胞量进行调节的。
Q8：PCR预扩增结束后的产物先稀释了5倍，然后再稀释10倍，为什么要这样做呢？为什么不一步稀释到位呢？低丰度，高丰度的基因都是稀释50倍吗？
A8：稀释5倍是作为储存液，再稀释10倍作为工作液。稀释的倍数是可以根据基因的表达量和样本量进行调整的，所以最好提前做个预实验判断一下。
Q9：配置好RT-PreAmp Master Mix后，冰上可以放置多长时间？
A9：放置时间越短越好，测试过冰上放置5 min左右没有问题。
参考文献
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