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22121 Single Cell Sequence Specific Amplification Kit

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22121 Single Cell Sequence Specific Amplification Kit

  • 规 格:
    • 200 rxns

货 号:

22121


价 格:

¥ 0

¥ 2150


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产品概述

产品描述

Single Cell Squence Specific Amplification Kit是基于一步RT-PCR的预扩增方法,适用于单细胞或者微量总RNA中转录组的扩增,便于进行单细胞转录组表达差异的分析。本试剂盒实现了RNA提取纯化、逆转录和PCR预扩增反应在同一管内完成,不需要额外的操作,简单高效,还能减少实验误差和污染风险。除了应用于单细胞,本试剂盒亦可适用于2 ~ 1,000个细胞的一步扩增,应用时仅需按照细胞数目减少一步扩增的循环数;获得的扩增产物适合于任何实时荧光定量PCR分析法。染料法和探针法qPCR分别推荐ToloBio通用型2 × Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal, #22204)和2 × Q3 probe qPCR Master Mix (Universal, #22205)。

 

 

产品组成

组分

22121 (200 rxns) 

2 × Tolo scAmp Reaction Buffer a

500 μL

RT/Taq Enzyme Mix b

40 μL

○ RNase-free ddH2O

2 × 1 mL

a.包含 dNTP;

b.包含RTase、RNase inhibitor和Taq DNA polymerase;

 

 

保存条件

-20℃保存,≤ 0℃运输;

 

 

产品优势

一步法RT-PCR预扩增:细胞裂解、RNA逆转录和PCR扩增在同一管内完成,不需要额外的移管操作。

一次可扩增500个靶基因:扩增产物适合用任何实时荧光定量PCR仪分析。

 

 

实验案例

分别使用ToloBio #22121与竞品Supplier A、Supplier B,对不同浓度的小鼠巨噬细胞进行一步法RT-PCR预扩增,产物进一步qPCR(ToloBio #22204)扩增,比较在相同引物和相同细胞个数条件下的扩增情况,包括扩增灵敏度、扩增线性和扩增平台。结果显示,ToloBio #22121在不同浓度细胞(1~1000个细胞/test)条件下扩增性能稳定、优异。

 

 

实验流程

1.Primer Pool的制备
将不同待测基因的扩增引物进行混合,制备成Primer Pool,使各引物的终浓度为0.1 μM。以Bcl-2基因为例,其上、下游引物原浓度均为100 μM,则应各取1 μL加入998 μL RNase-free ddH2O至终体积为1 mL。多个基因引物对的制备依此类推,最多可混合500对不同基因的扩增引物。

 

2.预扩增反应体系
在RNase-free离心管中冰上配制如下反应体系:

组分

体积 

2 ×Tolo scAmp Reaction Buffer 

2.5 μL

Primer Pool (0.1 μM)

0.5 μL

RT/Taq Enzyme Mix

0.2 μL

Cell sample c

0.5~1 μL

RNase-free ddH2O

Up to 5 μL

c.细胞可储存于PBS缓冲液中。

以上体系(除细胞样本外)充分混匀后冰上放置备用,可加入1~1000个细胞样本。为了使细胞充分破碎,将加入细胞样本的完整体系置于-80℃冰箱2 min,随后3,000 rpm (1,000 × g)室温或4℃离心2 min,然后立即放入PCR仪进行如下反应:

Stage

程序 

温度 

时间 

循环数 

Stage 1

反转录 50℃ 60 min 1 cycle

Stage 2

预变性 95℃ 3 min 1 cycle

Stage 3

循环反应 d 95℃ 15 sec 20 cycles
60℃ 15 min

Stage 4

Hold 4℃ - -

b.建议循环数随起始细胞数量作相应调整:1个细胞20个循环,10个细胞17个循环,100个细胞14个循环,1,000个细胞11个循环。 
反应结束后,每管加入20 μL RNase-free ddH2O (1:5稀释),用移液器吹打混匀,室温短离集于管底。可立即进行后续qPCR定量反应或-20℃短期保存。

3.qPCR反应体系
冰上配制如下反应体系:

 

组分

体积 

2 × Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal,#22204) 

10 μL

Primer F (10 μM)

0.5 μL

Primer R (10 μM)

0.5 μL

Template DNA e

1 μL

ddH2O

Up to 20 μL

c.为减少加样误差,建议将1:5稀释的预扩增产物再稀释10倍后使用。

以上体系充分混匀后,短暂离心集于管底,随后立即放入qPCR仪进行如下反应:

Stage

程序 

温度 

时间 

循环数

Stage 1

预变性 95℃ 5 min 1 cycle

Stage 2

循环反应 95℃ 10 sec 40 cycles
60℃ 30 sec

Stage 3

溶解曲线 仪器默认程序   1 cycle

 

常见问题解答

Q1:5 μl反应体系加入多少体积的样本?

A1:5 μl的反应体系下,加入的样本体积最好不要超过0.5 μl,如果样本体积较大,建议适当增大反应体系。

 

Q2:整个体系能否减半?

A2:可以,但是不建议,一步法体系较为复杂,大体系做效果更好。

 

Q3:可以适用于一个细胞的定量吗?检测的基因数量最多可以达到多少?会不会造成扩增偏好性?

A3:单细胞是可以的,亦可用于2-1000 cells或10 pg-100 ng RNA的样品;最多可混合500对不同基因的扩增引物;关于扩增偏好性,只要根据细胞数控制好循环数,不会造成偏好性。

 

Q4:样本不是分散开的细胞,而是一小块组织,可不可以用呢?组织是否可用裂解液进行裂解细胞?

A4:可以的,但是组织块不能太大,大约有几十个细胞量的组织块是可以的,但是超过这个范围,目前还没有案例。该产品反应体系只有5 μl,不兼容细胞裂解液,大量的裂解液会影响反应的进行,可以将组织进行液氮速冻,直接投入到反应体系即可。

 

Q5:引物可以使用Oligo dT或随机引物吗?

A5:不可以,因为该产品是RNA提取纯化、逆转录和PCR反应在同一管内完成,如果使用Oligo dT或随机引物无法达到预扩增的目的。

 

Q6:引物设计有何要求?

A6:
6.1 除了要符合常规的PCR引物设计要求外,还要注意区分外显子和内含子。
6.2 如果引物池存在2对以上的引物时,退火温度建议都是60℃左右。

 

Q7:逆转录时间设置为60 min,时间太长,是否可以缩短?退火、延伸这一步骤15 min,循环数20,可以把延伸时间和循环数调节一下?

A7:逆转录时间与扩增的基因数目也有关,最保险的是使其进行充分的逆转录,60 min可以保证充分逆转录。延伸时间可以根据后期要测试的基因数量进行调节,这里设置的15 min,是为了彻底逆转录500个基因,后续客户可根据细胞/RNA投入量进行调节;循环数20也是可以根据样本细胞量进行调节的。

 

Q8:PCR预扩增结束后的产物先稀释了5倍,然后再稀释10倍,为什么要这样做呢?为什么不一步稀释到位呢?低丰度,高丰度的基因都是稀释50倍吗?

A8:稀释5倍是作为储存液,再稀释10倍作为工作液。稀释的倍数是可以根据基因的表达量和样本量进行调整的,所以最好提前做个预实验判断一下。

 

Q9:配置好RT-PreAmp Master Mix后,冰上可以放置多长时间?

A9:放置时间越短越好,测试过冰上放置5 min左右没有问题。

产品说明书

#22121 Single Cell Sequence Specific Amplication Kit Manual

pdf

765.2KB

参考文献

COA查询

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